НАЙВАЖЛИВІШІ БІОХІМІЧНІ ПРОЦЕСИ, ЗБУДНИКАМИ ЯКИХ Є МІКРООРГАНІЗМИ
Мікроорганізми в процесі своєї життєдіяльності, тобто в процесі обміну речовин, утворюють різні продукти: спирти (етиловий, бутиловий, ізоаміловий), кислоти (молочну, оцтову, масляну, пропіонову), різні антибіотики, вітаміни та інші продукти. Багато продуктів, які утворюються мікроорганізмами, широко використовуються в народному господарстві. Отримання спирту, молочної, лимонної, оцтової кислот та різних антибіотиків базується на використанні життєдіяльності мікроорганізмів. На використанні біохімічних процесів, які збуджуються мікроорганізмами, ґрунтується виробництво вина, пива, квасу, бродіння тіста, різних кисломолочних продуктів, квашених овочів та ін. Одні й ті ж біохімічні процеси можуть бути корисними, якщо їх збудники свідомо використовуються людиною у виробництві тих чи інших продуктів, але й можуть приносити великі втрати, якщо ті процеси виникають спонтанно.
Деякі біохімічні процеси, збудниками яких є мікроорганізми, можуть приносити дуже велику шкоду народному господарству. До таких процесів відноситься, наприклад, псування продуктів в результаті гниття, руйнування деревини та ін.
Нижче розглядаються найбільш важливі біохімічні процеси, збудниками яких є мікроорганізми.
Спиртове бродіння
Серед всіх біохімічних процесів, пов'язаних з життєдіяльністю мікроорганізмів, найбільш широке використання в народному господарстві має спиртове бродіння.
Спиртове бродіння – це процес розкладу цукру на спирт та вуглекислий газ в результаті життєдіяльності мікроорганізмів.
С6Н12О6 ® 2С2Н5ОН+2СО2+27 ккал
Збудниками спиртового бродіння, як правило, є дріжджі, але деякі представники мукорових грибів і деякі бактерії (Sarcina ventviculi ) також можуть бути збудниками цього процесу.
У промисловості використовують тільки дріжджі Sach. ellipsoideus, що належать до сімейства Sacharomycetacea, рід Sacharomyces. Дріжджі, які спеціально культивують з метою промислового використання, називають культурними.
Процес спиртового бродіння з давніх часів використовується для отримання вина, пива та інших напоїв. Однак люди, використовуючи цей процес, не знали, що збудниками його є живі організми.
Зв’язок спиртового бродіння з життєдіяльністю дріжджів виявив тільки у середині ХІХ століття визначний французький вчений Луї Пастер.
Дріжджовій клітині притаманний дуже складний комплекс ферментів. Розвиваючись в анаеробному середовищі, дріжджі отримують енергію для життєдіяльності за рахунок спиртового бродіння. "Бродіння – це життя без кисню", – писав Луї Пастер, тобто життя за рахунок анаеробних перетворень речовин. Пізніше виявлено, що спирт може утворюватись дріжджами також в присутності кисню повітря, тобто дріжджі відносяться до факультативних анаеробів.
Спиртове бродіння може проходити і без участі живих дріжджових клітин, під впливом клітинного соку дріжджів. Клітинний сік отримували шляхом розтирання дріжджів з подрібненим гірським кришталем. Таким чином доведено, що процес спиртового бродіння викликається дріжджами тільки завдяки наявності в їхній клітині органічних каталізаторів – ферментів. Дослідження клітинного соку дріжджів, який отримували не тільки механічним руйнуванням клітин дріжджів, але й пресуванням, а також шляхом мацерації (настоювання з водою висушених дріжджів) показали, що він може викликати спиртове бродіння глюкози, фруктози, мальтози і сахарози. Сік втрачає здатність викликати процес спиртового бродіння при нагріванні його до 50˚ С. Активну основу клітинного соку, тобто фермент, що викликає процес спиртового бродіння, названо зимазою. Потім було виявлено, що зимаза – це не один фермент, а цілий їх комплекс.
Хімізм спиртового бродіння.Вище наведене сумарне рівняння спиртового бродіння. Насправді процес спиртового бродіння відбувається за складною схемою, з утворенням цілої низки побічних продуктів цього процесу.
Побічними продуктами спиртового бродіння є оцтова кислота, гліцерин, альдегіди, сивушні масла і деякі інші продукти.
Із вищенаведеного рівняння виходить, що із 1 г цукру можна отримати майже 0,5 г спирту і майже стільки ж вуглекислого газу. Але ще Пастером було доведено, що практичний вихід спирту нижчий, тому що частина цукру втрачається на утворення побічних продуктів (майже 5%) і живлення дріжджів (майже 1% ). Залежно від умов, в яких протікає процес спиртового бродіння, відношення окремих продуктів спиртового бродіння може змінюватися.
Біохімічні реакції в процесі спиртового бродіння проходять з участю різних ферментів, які знаходяться в кожній дріжджовій клітині. Умовно цей процес можна поділити на 7 стадій.
1 стадія: фосфорилювання гексоз. Ця стадія іде з участю ферменту фосфоферази, який сприяє перенесенню залишків фосфорної кислоти до гексози. Переносником фосфорної кислоти є аденілові кислоти. Останні вміщують фосфорну кислоту і входять до складу ядерних білків нуклеопротеїдів. Вони завжди є в дріжджових клітинах. Аденілові кислоти є донаторами та акцепторами фосфорних кислот у процесі спиртового бродіння, тобто вони то віддають фосфорну кислоту, то знов її зв’язують. Під час цього вони самі відповідно змінюються, переходячи під час віддачі фосфорної кислоти із аденезин-3-фосфату (АТФ) в аденезин-ди-фосфат (АДФ), а під час зв’язування фосфорної кислоти навпаки – із АДФ в АТФ. Кінцевим продуктом фосфорилювання, незалежно від того, який моносахарид піддається бродінню, є фруктозо-ди-фосфат.
| ОН | СН2ОРО3Н2 | |
| | | | | |
  H-C
| C-OH | |
  |
| | | |
| H-C-OH | OH-C-H | |
| | | | | |
| OH-C-H O | +2H3PO4 фосфофераза | H-C-OH О + 2Н2О |
   |
| | | |
 H-C-OH
| H-C | |
| | | | | |
 H-C
| CH2OPO3H2 | |
| | | ||
| CH2OH | ||
| Глюкоза | 1,6-фруктозо-ди-фосфат |
Одночасно АТФ АДФ.
ІІ стадія: розпад 1,6 фруктозодифосфату на 2 тріози. Ця реакція відбувається з участю ферменту альдолази. Одна із тріоз є фосфодиоксіацетоном, друга – фосфогліцериновим альдегідом.
| СН2ОРО3Н2 | CH2OPO3H2 | ||
| | | | | ||
| C-OH | C=O | Фосфодиоксіацетон | |
  |
| | | ||
| H-C-OH | CH2OH | ||
| | | + | ||
| OH-C-H O | альдоза | O | |
  |
| // | ||
 H-C
| C-H | Фосфогліцериновий | |
| | | | | альдегід | |
| CH2OPO3H2 | CHOH | ||
| | | |||
| CH2OPO3H2 |
Фосфодиоксіацетону утворюється 95%, фосфогліцеринового альдегіду – 5%. Це співвідношення залишається завжди постійним, тобто рівновага є рухомою. Якщо витрачається одна із тріоз, то її нестача поповнюється за рахунок ізомеризації іншої тріози. Реакцію ізомеризації тріоз каталізує фермент ізомераза.
ІІІ стадія: фосфодиоксіацетон і фосфогліцериновий альдегід вступають у взаємозв’язану окисно-відновну реакцію. При цьому фосфогліцериновий альдегід окиснюється в фосфогліцеринову кислоту, а фосфодиоксіацетон (кетон) відновлюється до гліцеринофосфату.
Реакція каталізується ферментом козимазою.
| O | CH2OPO3H2 | C-OOH | CH2OPO3H2 | |
| // | | | | | | | |
    C-H +
| C=H + | H2O козимаза | CHOH + | CHOH |
| | | | | | | | | |
| CHOH | CH2OH | CH2OPO3H2 | CH2OH | |
| | | ||||
| CH2OPO3H2 | ||||
| Фосфогліце-риновий альдегід | Фосфоди-оксіацетон | Фосфогліце-ринова кислота | Фосфогліце-рин |
ІV стадія: гліцеринфосфат дефосфорилюється. Під час цього фосфорна кислота поглинається аденозин-ди-фосфатом, який переходить в аденил-3 фосфат, а гліцеринфосфат (фосфогліцерин) переходить в гліцерин.
| CH2OPO3H2 | CH2OH | |
| | | | | |
 CHOH
| + АДФ енолаза | CHOH |
| | | | | |
| CH2OH | CH2OH | |
| Гліцеринфосфат | Гліцерин |
Гліцерин є одним із кінцевих продуктів спиртового бродіння, тобто подальших перетворень гліцерин не зазнає.
Гліцерин як побічний продукт бродіння накопичується в незначній кількості (3% від кількості утвореного спирту). Він утворюється тільки на початку спиртового бродіння, доки в середовищі не накопичиться достатньої кількості оцтового альдегіду.
V стадія: фосфогліцеринова кислота перетворюється в піровиноградну кислоту, а фосфорна кислота поглинається аденизиндифосфатом, який перетворюється в АТФ.
| COOH | COOH | |
| | | енолаза | | |
 C-HOH
| + АДФ фосфофераза АТФ + | C=O + H2O |
| | | | | |
| CH2OPO3H2 | CH3 | |
| Фосфогліцери-нова кислота | Піровиноград-на кислота |
VІ стадія: піровиноградна кислота декарбоксилюється і перетворюється в оцтовий альдегід та вуглекислий газ. Реакція каталізується ферментом декарбоксилазою.
| СООН | О | |
| | | // | |
 C=O
| декарбоксилаза | СН3-С-Н + СО2 |
| | | ||
| CH3 | ||
| Піровиноградна кислота | Оцтовий альдегід |
Вуглекислий газ, що утворюється під час цієї реакції, є одним із кінцевих продуктів бродіння. За наведеною вище схемою процес спиртового бродіння відбувається тільки на початковому етапі, доки в рідині, що бродить, не накопичиться достатньої кількості оцтового альдегіду. Коли ж з’являється оцтовий альдегід, він витісняє
із взаємозв’язаної окисно-відновної реакції фосфодиоксіацетон
(3 стадія) і стає на його місце. Окисно-відновна реакція відбувається тоді уже не між фосфодиоксіацетоном (кетоном) і фосфогліцериновим альдегідом, а між двома альдегідами, тому що між двома альдегідами цей процес проходить легше, ніж між кетоном і альдегідом. Таким чином, замість стадії ІІІ буде відбуватися наступна стадія (стадія VІІ ).
VІІ стадія:
| O | ||||
| // | ||||
| C-H | O | COOH | ||
| | | // | | | ||
| CHOH | + CH3-C-H + H2O | козимаза | CHOH | + C2H5OH |
 |
| | | |||
| CH2OPO3H2 | CH2OPO3H2 | |||
| Фосфоглі-цериновий альдегід | Оцтовий альдегід | Фосфогліце-ринова кислота | Етиловий спирт |
Фосфогліцериновий альдегід окиснюється до фосфогліцеринової кислоти, а оцтовий альдегід відновлюється до кінцевого продукту – етилового спирту.
Оскільки фосфодиоксіацетон не бере участі в процесі, гліцеринфосфат та гліцерин не утворюються, і процес весь час до закінчення бродіння відбувається у бік утворення етилового спирту (стадія 7).
Схематично весь процес спиртового бродіння наведено нижче.
| Глюкоза + Н3РО4 фосфофераза (АТФ ® АДФ) | ||||||||||||||||||
| 1 стадія | ||||||||||||||||||
| 1,6 фруктозодифосфат + Н2О | ||||||||||||||||||
| 2 стадія | ||||||||||||||||||
| Фосфодиоксіацетон | Фосфогліцериновий альдегід | |||||||||||||||||
| +Н2О | ||||||||||||||||||
| козимаза | ||||||||||||||||||
| 3 стадія | Окиснення | |||||||||||||||||
| Фосфогліцерин | Фосфогліцеринова кислота | |||||||||||||||||
| 4 стадія | 5 стадія | |||||||||||||||||
| Гліцерин | Піровиноградна кислота | |||||||||||||||||
| 6 стадія | ||||||||||||||||||
| декокарбоксилаза | ||||||||||||||||||
| Оцтовий альдегід + СО2 ↑ | ||||||||||||||||||
| 7 стадія козимаза + Н2О | ||||||||||||||||||
| Відновлення до С2Н5ОН | ||||||||||||||||||
| Схема спиртового бродіння. | ||||||||||||||||||
Гліцеринова форма спиртового бродіння.Із наведеної схеми видно, що гліцерин утворюється тоді, коли в середовищі немає оцтового альдегіду. Таким чином, щоб під час спиртового бродіння накопичити гліцерин, необхідно виключити з реакцій оцтовий альдегід. Це зробити дуже просто. Кислий сірчанокислий натрій (NaHSO3) утворює з оцтовим альдегідом комплексну нерозчинну сполуку. Тому якщо в рідину, що бродить, ввести NaHSO3, то оцтовий альдегід зв’язується і виводиться з реакції. У такому випадку окисно-відновна реакція знову відбуватиметься за рівнянням ІІІ стадії між фосфогліцериновим альдегідом і фосфодиоксіацетоном з утворенням фосфогліцерину і за реакцією ІV стадії – з утворенням гліцерину. У зв’язку з цим замість етилового спирту в результаті бродіння буде накопичуватись гліцерин.
Сумарне рівняння процесу бродіння є таким:
| О |
| // |
 С6Н12О6 С3Н5(ОН)3 + СН3С–Н + СО2
|
| Зв’язаний |
| NaHSO3 |
Таким чином, на практиці вдається отримати 40% гліцерину (по відношенню до забродженого цукру).
Гліцерин можна отримати також, якщо спиртове бродіння проводити у лужному середовищі. Нормальне спиртове бродіння відбувається в кислому середовищі при рН 4–5. При рН 8 відбувається вже не спиртове бродіння, а гліцеринове. Під час цього бродіння оцтовий альдегід із реакції не виводиться, а паралельно відбуваються два окисно-відновні процеси: між фосфородиоксіацетоном і фосфогліцериновим альдегідом за реакціями ІІІ і ІV стадій з утворенням гліцерину і між двома молекулами оцтового альдегіду з утворенням спирту.
| О О |
| // // |
| СН3С–Н + СН3С–Н + Н2О ® СН3СООН + С2Н5ОН |
| оцтова етиловий кислота спирт |
У лужному середовищі утворюється менше гліцерину, ніж тоді, коли під час бродіння в рідину вводиться NaHSO3.
Побічні продукти спиртового бродіння.Оскільки спиртове бродіння відбувається через низку проміжних продуктів, то окрім головних продуктів бродіння – етилового спирту та вуглекислого газу в невеликих кількостях утворюються побічні продукти, а саме: гліцерин, оцтова кислота, оцтовий альдегід, складні ефіри, сивушні масла та ін.
Сивушні масла – це суміш високомолекулярних спиртів, головним чином, бутилових і амилових. Сивушні масла утворюються не із цукру, а в результаті розкладу різних амінокислот, що споживаються дріжджами поряд з цукром як живильні речовини.
Під час виробництва спирту побічні продукти не бажані. Їх усувають шляхом перегонки та ректифікації, яка ґрунтується на різних температурах кипіння спирту і побічних продуктів бродіння. Під час виробництва вина та пива побічні продукти відіграють важливу роль в утворенні букету цих продуктів.
Умови та використання спиртового бродіння. Великий вплив на інтенсивність спиртового бродіння має концентрація цукру в рідині, що бродить. Найкраще проходить спиртове бродіння при концентрації цукру 15%. При концентрації цукру 30% дріжджі сповільнюють процес спиртового бродіння, а деякі дріжджі зовсім його призупиняють. Тільки один вид дріжджів Zigosach. Priorianus може викликати спиртове бродіння при значній концентрації цукру – до 80%. Саме цей вид дріжджів є причиною псування меду та варення.
Суттєвий вплив на процес спиртового бродіння має також температура та реакція середовища. Найсприятливішою температурою для спиртового бродіння є температура 30°С, при температурі 50° С бродіння призупиняється, а при температурі 60–70° С дріжджі гинуть.
Процес спиртового бродіння проходить нормально, якщо реакція рідини, що бродить, кисла. Оптимальне значення величини рН для спиртового бродіння перебуває у межах 4–5.
Збудники спиртового бродіння – дріжджі є факультативними анаеробами, тому процес спиртового бродіння краще проходить, коли відсутній кисень повітря.
Існують два типи спиртового бродіння – верхове і низове. Верхове бродіння проходить дуже швидко. Воно супроводжується сильним виділенням вуглекислого газу і піни. Дріжджі під час верхового бродіння виносяться вуглекислим газом, який виділяється дуже інтенсивно на поверхню рідини, тому бродіння і називається верховим. Таке бродіння застосовується під час виробництва спирту і вина і проходить при температурі, близькій до оптимальної.
Низове бродіння проходить спокійніше і повільніше. Піни утворюється значно менше, тому дріжджі весь час залишаються на дні посуду. Низове бродіння проходить при температурі суттєво нижчій, ніж оптимальна – близько 10°С. Воно використовується під час пивоваріння.
Дріжджі можуть перетворювати в спирт тільки цукри – моносахариди і дисахариди. Тому під час виробництва спирту із крохмалистої сировини (картоплі, зерна) крохмаль перед бродінням перетворюють в цукор (гідролізують). Гідроліз проводять за допомогою мінеральних кислот або за допомогою солоду (пророслого зерна). В ньому є фермент амілаза, який перетворює крохмаль в цукор.
| амілаза |
| (С6Н10О5)n + nН2О ® nC6Н12О6 |
Спирт, що утворюється в результаті бродіння, пригнічує розвиток дріжджів. Більшість дріжджів може доводити вміст спирту в рідині, що бродить, до 12–16%. Вищі концентрації спирту діють згубно на дріжджові клітини і вони гинуть. Тому натуральними називають тільки столові вина, в яких вміст спирту не перевищує 12%. Десертні й міцні вина, в яких вміст спирту перевищує 16%, – це вина спиртовані, тобто вміст спирту в них підвищується додаванням спирту – ректифікату.
Спиртове бродіння використовується також під час виготовлення хліба. Вуглекислий газ, який утворюється під час спиртового бродіння, піднімає тісто, розпушує його, і після випікання отримують пишний пористий хліб.
Разом з молочнокислим, спиртове бродіння використовують під час виготовлення молочних продуктів: кефіру, кумису, а також під час квашення плодів та овочів.
Спиртове бродіння може приносити і шкоду. Наприклад, свіжі ягоди можуть псуватись в результаті розвитку на них дріжджів. Такі ягоди мають присмак спирту (колючий смак). Потім такі ягоди закисають під впливом оцтовокислих бактерій, що окиснюють спирт до оцтової кислоти.
В результаті спиртового бродіння можуть також псуватися варення та мед.
Молочнокисле бродіння
Молочнокисле бродіння – це процес перетворення цукру в молочну кислоту в результаті життєдіяльності молочнокислих бактерій.
Молочнокисле бродіння використовувалось людьми з давніх часів, однак природа цього бродіння була з’ясована відносно недавно.
Луї Пастер в 1857 р. довів, що молочнокисле бродіння викликається мікроорганізмами, але виділити збудників цього бродіння у вигляді чистих культур йому не вдалося. Чиста культура збудників молочнокислого бродіння була виділена тільки в 1878 р. і вивчена більш детально у 1894 – 1895 рр.
На сьогодні відомо багато різних бактерій, які ферментують цукор з утворенням молочної кислоти. При цьому деякі з них перетворюють цукор тільки в молочну кислоту, інші, поряд з молочною кислотою, утворюють побічні продукти (оцтову, янтарну кислоти, етиловий спирт, вуглекислий газ, водень та інші продукти).
Якщо в процесі молочнокислого бродіння із цукру утворюється тільки молочна кислота, то такий процес називається типовим (гомоферментативним) молочнокислим бродінням. Якщо ж при бродінні поряд з молочною кислотою утворюються інші продукти, то такий процес називається нетиповим (гетероферментативним) молочнокислим бродінням.
Хімізм молочнокислого бродіння.Процес типового молочнокислого бродіння можна виразити таким сумарним рівнянням:
С6Н12О6 ® 2СН3СНОНСООН,
а нетипового:
| СН2СООН |
| 2С6Н12О6 ® СН3СНОНСООН+СН3СООН+ | +С2Н5ОН+СО2+Н2 |
| СН2СООН |
Це тільки загальні рівняння, а насправді процес відбувається за дуже складною схемою, через низку проміжних продуктів.
До моменту утворення піровиноградної кислоти процес проходить за такою ж схемою, як і спиртове бродіння. Далі, у зв’язку з відсутністю у молочнокислих бактерій ферменту карбоксилази (піроватдекарбоксилази), реакція декарбоксилювання піровиноградної кислоти не відбувається. Натомість, завдяки ферменту лактикодегідрогенази, що притаманний молочнокислим бактеріям, піровиноградна кислота вступає в окисно-відновну реакцію з фосфогліцериновим альдегідом. При цьому в результаті відновлення піровиноградної кислоти утворюється молочна кислота, а в результаті окиснення фосфогліцеринового альдегіду – фосфогліцеринова:
| Лактикоде- | |||||||||||||
| O | гідрогеназа | ||||||||||||
| // | + Н2О | ||||||||||||
 CH3COCOОH+ C-H
| CH3CHOHCOOH+ | COOH | |||||||||||
| | | | | ||||||||||||
| CHOH | CHOH | ||||||||||||
| | | | | ||||||||||||
| CH2OPO3H2 | CH2OPO3H2 | ||||||||||||
| Піровино-градна кислота | Фосфоглі-цериновий альдегід | Молочна кислота | Фосфоглі-церинова кислота | ||||||||||
Процес гетероферментативного молочнокислого бродіння відбувається за значно складнішою схемою.