А) яким методом його зафіксувати?
Завдання№1.
В бактеріологічну лабораторію доставлено гній з післяопераційної рани хворого. Нагноєння рани почалося на 3 добу після операції з приводу флегманозного аппендициту:
а) виготовити мазок із гною та зафіксувати хімічним способом
б) пофарбувати препарат за методом Грама
в) провести мікроскопію препарату та визначити морфологію і тинкторіальні властивості мікроорганізмів
Эталон ответа:
1. Приготовление мазка из гноя
Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла . Затем вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы остались свободными треть первого и второго стекол. Стекла раздвигают в стороны и получают два отдельных больших мазка.
Фиксация мазка химическим методом может осуществляется при помощи этилового 95% спирта. Время фиксации 10-15 мин.
2. Окраска препарата по Граму
На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтрованной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генцианового фиолетового на 0,5-1 мин. Сливают краситель, и, не смывая, наливают раствор Люголя на 1мин. Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в 95% спирте в течении 0,5-1 мин, пока не перестанет отходить краситель. Промывают водой. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течении 0,5-1 мин. Краситель сливают, препарат промывают и высушивают.
3. В поле зрения обнаруживаются грамположительные кокки (фиолетовый цвет) сферической формы, образующие скопления в виде виноградных гроздей. Возбудитель – стафилококк.
Завдання№2.
При постановці розгорнутої реакції аглютинації (РА) з метою серологічної діагностики лептоспірозу сироватку розводили від 1:50 до 1:1600.
Визначити який титр сироватки, якщо в пробірці КС – прозора рідина, у КА – мутність, у 1-й і 2-й дослідних пробірках осад має оцінку на ++++, у 3-й і 4-й на +++, у 5-й - ++, у 6-й - +.
Эталон ответа:
Развернутая реакция агглютинации используется для определения серогруппы, серовара микроорганизмов. Все ингредиенты разливают по пробиркам в определённой последовательности. Сыворотку разводят 2-кратно – 1:100, 1:200, 1:400 и т.д.
КС – 1:50
1 пробирка – 1:100
2 пробирка – 1:200
3 пробирка – 1:400
4 пробирка – 1:800
5 пробирка – 1:1600
6 пробирка - ?
Учет реакции агглютинации производят оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании.
Реакцию учитывают как положительную при наличии отчетливой агглютинации, выраженной не менее ++ в опытной пробирке, и отсутствии агглютинации в обоих контрольных пробирках. За титр сыворотки принимают последнее её разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем ++.
Завдання№3.
В бактеріологічній лабораторії з випорожнень хворого на гострий гастроентерит виділена чиста культура лактозонегативних бактерій. З метою диференціації рухливих бактерій (сальмонели) від нерухомих (шигели):
а) виготовити препарат ”роздавлена” крапля
б) які методи мікроскопії використовують для визначення рухливості бактерій
в) провести мікроскопію виготовленого препарату
Эталон ответа:
1.Нанести бактериологической петлёй каплю исследуемого материала на середину предметного стекла. Поставить покровное стекло на ребро возле края капли. Опустить покровное стекло на каплю. Придавить слегка пинцетом. Проверить правильность приготовления препарата: капля материала не должна выступать за края покровного стекла и под покровным стеклом не должно быть пузырьков воздуха.
2.Для изучения подвижности бактерий используют такие методы микроскопии как приготовления препаратов ”раздавленная капля” и ”висячая капля”.
3.При изучении приготовленного препарата под световым микроскопом край капли сначала отыскивают со слабым увеличением и при суженной диафрагме, а потом исследуют препарат при помощи более сильного увеличения. Более удобными для их микроскопического изучения представляются такие виды микроскопии, как темнопольная, фазово-контрастная и аноптральная.
Вывод: бактерии рода Salmonella-палочковидные, немного овальные клетки с перитрихиально расположенными жгутиками, подвижны. Бактерии рода Shigella-палочковидные клетки, не имеющие жгутиков, неподвижны.
Завдання№4.
Для роботи в мікробіологічній лабораторії необхідні стерильні халати, піпетки, чашки Петрі:
а) вибрати способи стерилізації зазначених предметів
б)обгрунтувати вибір того чи іншого методу стерилізації
в)продемонструвати підготовку піпеток до стерилізації
Эталон ответа:
1. Стерилизация – это процесс умерщвления в объекте или удаления из него микроорганизмов всех видов, находящихся на всех стадиях развития.
Лабораторную посуду перед стерилизацией моют и сушат. Материалы после стерилизации должны оставаться стерильными, поэтому перед стерилизацией посуду закрывают пробками, крышками, а также посуду заворачивают в бумагу или кладут в пакеты, пеналы.
Паровой метод стерилизации осуществляется насыщенным водяным паром при избыточном давлении 0,11 Мпа и температуре 120 С;0,20 Мпа и температуре 132 С. Этим методом стерилизуют спецодежду в паровых стерилизаторах – автоклавах. Время стерилизационной выдержки при 120 С – 45 мин.
Сухожарочный шкаф используется для высушивания лабораторной посуды, а также для её стерилизации. При температуре 180 С не менее 60 минут.
3. Подготовка пипеток к стерилизации:
Нарежьте полоски бумаги размером 2 – 2,5 *50 – 70 см
Отсортируйте пипетки по объёму
Вставьте в верхнюю часть пипеток кусочки ваты, ворсинки ваты сожгите в пламени спиртовки
Плотно заверните каждую пипетку в полоску бумаги, начиная с тупого конца
Подготовьте лист плотной бумаги размером приблизительно 20*40 см
Сложите завернутые пипетки на этот лист в одном направлении
Заверните все пипетки в этот лист бумаги
Закрепите концы резиновыми кольцами
Подпишите на бумаге объём пипеток, их количество, дату стерилизации.
Завдання№5.
Які існують методи взяття крові у тварин?Як виготовити із крові сироватку й плазму?
Эталон ответа:
Манипуляции – при взятии крови у животных различные, они зависят от вида животных и методов взятия крови. Небольшое количество крови берут из вен уха, хвоста, внутренней поверхности крыла. Больше крови берут из сердца крысы, кролика, морской свинки, локтевой вены(у обезьяны), вен бедра, сонной вены коня, большого рогатого скота. В особых случаях проводят тотальное обескровлевание. Недостатком этого метода является то, что животное гибнет.
Перед взятием крови у лабораторных животных на участке тела, где будет сделан прокол, сначала удаляют шерсть, обезжиривают и дезинфицируют кожу спиртом, эфиром или спиртовой настойкой йода. После взятия крови на место укола накладывают ватный тампон, пропитанный спиртовым раствором йода, а животному вводят подкожно подогретый до t=37 С стерильный изотонический раствор натрия хлорида или раствор глюкозы в объёме, в два раза превышающий объём взятой крови.
Приготовление сыворотки крови:
Для получения прозрачной сыворотки крови у животных следует брать натощак. После приёма животными корма, а иногда и при повторных кровопусканиях с маленьким интервалом в крови возникает липемия(накопление избытка жира). Сыворотка, полученная из такой крови, будет мутной, поэтому результаты серологических реакций могут быть ошибочными. Кровь собирают в пробирку, не допуская образования пены. Для этого струйку крови, которая вытекает из кровеносного сосуда, направляют на стенку пробирки. Пробирку с кровью можно оставить при комнатной температуре на 3-4 часа. Для более эффективного сворачивания кровь ставят в термостат при температуре 37 С на 20-30 мин (дольше кровь в термостате оставлять нельзя – произойдет гемолиз). Образовавшийся сгусток крови отделяют от стенок пробирки стерильной пастеровской пипеткой или бактериологической петлёй и ставят в холодильник на 1 час или цетрифугируют. Хорошо отстоянную сыворотку получают при отстаивании крови на протяжении 18-20 часов. Хранить сыворотку над осадком можно не дольше чем 48 часов (при более длительном хранении происходит гемолиз). Если сыворотка будет использована позже, чем через 48 часов, её отсасывают стерильной пастеровской пипеткой и переносят в стерильную пробирку.
Приготовление плазмы крови:
Плазму готовят из цитратной крови. Для этого цитратную кровь ставят в холодильник на 18-20 часов или центрифугируют. Над осадком форменных элементов крови образовывается слой слегка мутной жидкости светло-желтоватого цвета. Плазма отличается от сыворотки тем, что в ней содержится белок фибриноген.
Завдання№6.
На чому грунтується ланцюгова полімеразна реакція(ЛПР)? Який принцип її проведення? Як враховують її результати?
Эталон ответа:
Любой метод ДНК-диагностики основан на специфической гибридизации двух нитей ДНК, комплементарных (структурно дополняющих) одна другой. Примерной (хотя и весьма приблизительной) аналогией может служить серологическая реакция, основанная на специфической реакции белка-антитела с соответствующим антигеном. Специфичность связывания нитей в спирали ДНК основана на связях А-Т и Г-Ц. Праймеры комплементарны искомым участкам ДНК, и поэтому они способны связываться с конкретными участками гена. Достройка нитей ДНК, начиная с добавленных праймеров, требует наличия в реакционной смеси пурин-и пиримидинтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ и ЦТФ), а также присутствия ДНК-полимеразы, которая соединяет их в цепочку согласно последовательности второй нити ДНК.
Осуществление рутинных методик ПЦР
Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, сок простаты, слюна, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.
Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.
Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150 °С в течение 1 часа.
1. Выделение ДНК из клинического образца производится любым способом. Основное требование - достаточно стандартный выход продукта и интактность, сохранение двухнитевой структуры.
Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. В случаях, когда не требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, при идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна их обработка, позволяющая лишь разрушить микробную стенку: нагревание в лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК. При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.
В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее - природой его клеточной стенки.
Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, применяют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и, в первую очередь, от ингибиторов Taq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании сорбентов. Подготовка материала с его использованием занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может быть применена, так как не гарантирует удаление возможных ингибиторов.
2. Амплификация. Полимеразная цепная реакция ДНК проводится в специальном приборе (термоциклере или амплификаторе), который, согласно введенной программе, изменяет температуру в рабочих ячейках, держит ее в течение заданного времени и переходит к следующему этапу.
Каждый цикл ПЦР обычно состоит из трех температурных режимов.
а) Нагрев до 95 °С в течение 30-40 сек. При этом выделенные молекулы ДНК подвергаются денатурации, т. е. происходит разделение ДНК на две нити.
б) Охлаждение до оптимальной температуры (обычно 48-66 °С). При этом разделенные нити ДНК могут обратно воссоединиться по комплементарным участкам. Однако, при наличии в образце целевых участков ДНК, синтетические ДНК-зонды (праймеры, длиной 15-30 п.н.) специфически связываются (гибридизуются) с комплементарными участками ДНК, например хламидии или герпесвируса. Тем самым ограничиваются искомые участки генов, определяя точки начала и окончания предполагаемого продукта ПЦР. Время отжига 20-60 сек.
в) После завершения гибридизации праймеров с искомыми участками ДНК, температуру смеси повышают до 72 °С. Эта температура оптимальна для фермента Таq ДНК-полимеразы, которая начинает быстро достраивать одну и другую цепочку ПЦР-продукта, начиная с места фиксации, соответственно, одного и второго ДНК-зонда. Этот процесс называется элонгацией (т. е. удлинением) ПЦР-продукта, сами же продукты ПЦР именуют ампликонами. Время протекания синтеза - 20-40 сек.
При первом цикле ПЦР получается некоторое число ампликонов различной длины, которые служат субстратом во втором цикле реакции, где количество специфических продуктов удваивается еще раз. В каждом из последующих циклов (всего до 35-40) происходит двукратное возрастание числа целевых продуктов ПЦР-ампликонов.
Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и качества 5 основных компонентов реакционной смеси (ДНК-матрицы, Taq-полимеразы, праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и ионов Mg) и температурного режима ПЦР.
Даже при оптимальных концентрациях фермента, ионов Mg, праймеров и dNTP специфичность и чувствительность ПЦР очень сильно зависит от температуры отжига праймеров (2-я стадия цикла ПЦР): неспецифичность ПЦР-амплификации повышается при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентраций праймеров и dNTP выше оптимальных, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК вплоть до ее полного исчезновения.
3. Детекция.
Способы учета результатов ПЦР:
Качественная оценка (электрофоретический метод)
Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет", как, например, при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др. Обычным способом разделения продуктов ПЦР и идентификации специфического гена является электрофорез в агарозном или (реже) полиакриламидном геле. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена. Положительный контроль может представлять собой целевую ДНК или участок гена, клонированный в плазмиде или амплифицированный с помощью ПЦР.Для учета результатов качественной ПЦР может быть использован и метод флуоресцентной детекции. Для этого по окончании ПЦР определяют наличие или отсутствие специфического сигнала с помощью специальных флуориметров (так называемый flash-метод). Поскольку здесь нет необходимости и в электрофоретическом оборудовании, то очевидна существенная экономия рабочих зон и реагентов для лаборатории.Методы учета результатов ПЦР без применения электрофореза наиболее уместны и выгодны для многопрофильных лабораторий, где ПЦР-методы составляют лишь некоторую часть общего производственного процесса.В таких крупных лабораториях часто определяется лишь ограниченный круг наиболее востребованных микроорганизмов. На российском рынке предлагается целый ряд flash-наборов для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, и ряда вирусных инфекций. Этот ассортимент патогенов вполне достаточен для многих больничных лабораторий, и они могут с начала своей деятельности сделать акцент на подобных методах анализа.
Количественная оценка результатов ПЦР
В ряде клинических ситуаций возникает вопрос о динамике патологического процесса и/или эффективности проводимой терапии. Эти вопросы наиболее актуальны при обследовании пациентов с хроническими инфекциями (гепатиты В и С, вирус иммунодефицита человека и др.). При диагностике исходят из того, что накопление продуктов ПЦР (ампликонов) пропорционально содержанию копий искомого гена в исследуемой пробе.Естественно, учет результатов количественной ПЦР можно проводить и с помощью гель-электрофореза с анализом интенсивности специфических сигналов ПЦР. Обязательным условием правильной количественной оценки результатов ПЦР являются надежные положительные контрольные пробы с известным содержанием копий искомого гена (например, 1000 копий гена гепатита С на одну ПЦР-реакцию). Ряд последовательных разведений количественного контроля дает возможность построить калибровочные кривые, по которым можно оценивать содержание генокопий в клинических образцах .Ключевым достижением в проведении количественной ПЦР стала разработка флуоресцентных ДНК-зондов, которые добавляются в реакционную смесь наряду с "обычными" праимерами и дают возможность отслеживания хода ПЦР во времени (так называемая геа1-timе-ПЦР), которая в 1993-1994 гг. была внедрена в.соответствующих приборах и диагностических системах (принцип ТаqМаn). Существует еще несколько методов конструирования ДНК-зондов для количественной ПЦР.Методология ТаqМаn предусматривает синтез флуоресцентных ДНК-зондов, специфичных к средней части ампликона (между праймерами) и имеющих на концах две метки. Одна из них - флуоресцентная молекула, другая - молекула-гаситель этой флуоресценции. Таq-полимераза в ходе ПЦР не только достраивает нуклеотидную цепочку, но и разрушает связанный флуоресцентный зонд. При этом флуоресцирующая метка выходит в свободное состояние, освобождаясь от влияния гасителя. Поэтому интенсивность флуоресценции по мере амплификации продуктов ПЦР возрастает пропорционально числу ампликонов и, соответственно, числу копий исходной ДНК. Специальный прибор, являющийся гибридом термоблока-амплификатора и флуориметра, осуществляет регулярные замеры флуоресценции в каждой пробирке (принцип геаl-timе-ПЦР). В результате после 20-40 циклов ПЦР для каждого образца получают индивидуальные кривые. По калибровочным кривым с контрольными образцами возможно вычислить, сколько копий искомого гена содержится в изучаемом образце.Важная особенность проведения ПЦР флуоресцентным методом состоит в том, что пробирки с ПЦР-смесью не нужно открывать при учете результатов. Благодаря этому уменьшается вероятность загрязнения помещений продуктами амплификации и отпадает необходимость в выделении специальных рабочих зон для проведения электрофореза.
Завдання № 7.
Для мікроскопічної діагностики гонореї відібрали патологічний матеріал з сечоводу хворого, який скаржився на різкій біль під час сечовиділення. Виготовили мазок із гною.
а) яким методом його зафіксувати?
б) пофарбувати препарат, щоб визначити бактерії в гної та їх розміщення внутрішньоклітинно чи позаклітинно
в) охарактеризувати морфологічні та тинкторіальні ознаки гонококів
Эталон ответа:
Фиксируют при комнатной t или в пламени горелки. Окрашивают по Граму. Используют бактериоскопический метод.
В образовании гноя принимают участие патогенные кокки: Staf, Strep, Gon, Mening(Нейсерия).Гонококки- диплококки бобовидной формы, в мазке размещены за или внутри клетки, неподвижны, спор и капсул не образуют. Красятся метиленовым синим и по Граму –явление незаконченного фагоцитоза.
Завдання № 8
При постановці орієнтованої реакції аглютинації (РА) на склі з метою серологічної ідентифікації культури сальмонел в краплі сироватки утворилися пластівці. Оцінити результати реакції.
Эталон ответа:
Приготовить смесь 5-ти ОК- сывороток. Против сальмонел. Для этого аждую сыворотку приготовить в разведении 1:5 и в разных объемах смешать. Затем к 5млсыворотки добавить 5 мл NaCl.На предметное стекло нанести каплю р-ра NaCl и каплю приготовленной смеси сывороток. Рассмотреть рост микроорганизмов на чашке Петри на среде Эндо.
Р-ия происходит при комнатной t(5-10 мин учитывать результат)
«+» в сыворотке появляются хлопья
«-»жидкость равномерно мутная
Завдання №9
У хворого на цистит при бактеріологічному дослідженні сечі виділили чисту культуру синьогнійної палички. Провести дослідження щодо визначення чутливості виділеної культури до антибіотиків методом індикаторних дисків.
Эталон ответа:
Метод индикаторных дисков используют для определения чувствительности микрофлоры к антибиотикам. Оптимальным выбором антибиотиков для данного возбудителя главного заболевания обеспечивает высокое клиническое качество лечения.
Ход роботы: возбудитель данного заболевания – высеянная культура, пат. материала на ч. Петри с соответствующей питательной средой.
Учет результата: наибольшая зона задержки роста около одного из антибиотиков (дисков) свидетельствует о высокой степени эффективности данного антибиотика. Термостат на 18-24 часа при t=34.
Задание №10
Яких правил поведінки та техніки безпеки слід дотримуватись в мікробіологічній лабораторії?
Эталон ответа:
1.Запрещается приём пищи в лаборатории
2.Придерживание рабочего места согласно требованиям
3.Придерживание правил работы с патологическим матеріалом
4.Предупреждение инфицирования работников лаборатории
5.Проверять стеклянную посуду на целостность
6.Набирать растворы только грушей или дозированной пипеткой
7. После работы не оставлять инфицированные материалы
8.В комнате нельзя держать цветы и домашних животных
Завдання № 11
Визначити сахаролітичні властивості ентеробактерій на середовищах Гісса.
З якою метою визначають ферментативну активність мікроорганізмів?
За якими ознаками визначають продукти розщеплення вуглеводів?
Эталон ответа:
Ферментативную активность определяют для дифференцировки бактерий кишечной семьи одной от другой. Чем больше микроб патогенен, тем менее он активен в ферментативном отношении.
-Перекрашивание среды в синий или голубой цвет указывает на ферментацию сахара с образованием кислоты.
-образование пузырьков-с образованием газа
-нет, среда не меняет цвет, но мутнеет.
Завдання № 12
Правила взяття, транспортування, приймання та реєстрації патологічного матеріалу для лабораторних досліджень.
Эталон ответа:
Правильный сбор и доставка- это высокая эффективность!
Задание № 19.
Какие методы используют для лабораторной диагностики туберкулеза? Какой материал используют для исследования? Алгоритм подготовки нативного препарата для исследования. Какие питательные среды используют для выделения чистой культуры микобактерий?
Эталон ответа:
Для лабораторной диагностики туберкулеза используют бактериоскопический, бактериологический методы, заражение животных, аллергические кожные пробы и серологические реакции.
Материалом для исследования в зависимости от локализации процесса служит мокрота, спинномозговая жидкость, гной, моча, испражнения, пунктаты лимфатических узлов.
Подготовка нативного препарата для исследования: материал, поступивший на исследование, помещают в чашки Петри и ставят на черную поверхность. Бактериальной петлей выбирают гнойный комочек, переносят его на середину предметного стекла и накрывают покровным стеклом. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Для обнаружения микобактерий туберкулеза, мазки окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют. Фон препарата имеет голубовато-синий цвет. На этом фоне различают микобактерии красного цвета в виде тонких, слегка изогнутых палочек различной длины.
Микобактерии туберкулеза неравномерно распределяются в мокроте. Для их концентрации пользуются методом флотации (метод обогащения). 10-15 мл свежей мокроты помещают в стерильную узкогорлую бутылку. Прибавляют равное количество 0,5 % раствора едкого натра. Встряхивают в течение 10-15 мин в аппарате для встряхивания. Затем приливают 2 мл бензола и 100 мл воды, снова встряхивают 10-15 мин. Отстаивают при комнатной температуре около часа. При отстаивании на поверхности жидкости появляется флотационное кольцо. Это кольцо отсасывают пастеровской пипеткой и переносят на 2 предметных стекла. Мазки подсушивают, окрашивают по Цилю-Нильсену.
Для выделения чистой культуры используют питательную среду Левенштейна-Йенсена. Применяется также метод микрокультур Прайса, который позволяет вырастить микобактерии в течение 3-10 дней.
Задание № 20.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений. В чем суть этого метода? Определить МПК антибиотика, если концентрация антибиотика в пробирке № 1- 400 мкг/мл, а рост культуры микроорганизмов отсутствует в первых четырех пробирках.
Эталон ответа:
Мясо-пептонный бульон (или какой-либо другой, на котором растет изучаемый микроб) разливают по 1 мл в пробирки, расставленные в штативы по 10 в ряду. В первую пробирку вносят 1 мл раствора антибиотика в концентрации 200 мкг/мл. После перемешивания переносят мерной пипеткой 1 мл из этой пробирки во вторую, перемешивают и переносят то же количество смеси из второй в третью и т.д. до девятой пробирки, из которой 1 мл выливают, чтобы во всех пробирках объем жидкости был одинаков. Десятая пробирка, не содержащая препарат, служит контролем на рост культуры микроорганизма. После этого во все пробирки, содержащие серийно разведенный препарат, и в контрольную пробирку вносят одинаковое количество взвеси тест-культуры. Для этого 18-часовую культуру или 48-часовую культуру (для микроорганизмов, у которых замедлен рост) испытуемого микроба на косом агаре смывают физраствором, доводят до густоты 5 ЕД по стандарту мутности с последующим разведением до нужного количества микробных клеток в 1 мл и вносят в пробирки с серийно разведенным препаратом. Результаты учитывают, определяя наличие или отсутствие роста микроба в среде, содержащей различные разведения антибиотика. Последняя пробирка с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует МПК (минимальная подавляющая рост концентрация) препарата в отношении испытуемого штамма и указывает на степень его чувствительности. Если среда помутнела во всех пробирках, то испытуемый микроб устойчив к максимально взятой в опыт концентрации антибиотика. Отсутствие роста во всех пробирках, кроме контрольной, свидетельствует о том, что МПК препарата в отношении микроба ниже используемой концентрации.
Задание № 21.
В чем особенность культивирования облигатных анаэробов. Методы культивирования облигатных анаэробов.
Эталон ответа:
Облигатные анаэробы - это бактерии, использующие сульфатный тип дыхания, они не способны расти в присутствии кислорода. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и внешнего пространства. Для культивирования анаэробов применяют физические, химические и биологические методы.
Физические методы:
1. Кипячение среды-наиболее простой способ удаления растворенного в ней кислорода. Для этого перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят на водяной бане в течение 10-20 мин, в результате чего из среды вытесняется воздух. Свежепрокипяченную среду охлаждают под струей холодной воды, чтобы не произошло насыщение ее кислородом. Среду засевают материалом и заливают сверху вазелиновым маслом.
2. Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества. В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту. Активно связываются с кислородом воздуха животные ткани паренхиматозных органов (печени, селезенки). Применяют неорганические восстановители-сульфиды, сероводород.
· Среда Китта-Тароцци. В ее состав входят мясо-пептонный бульон и говяжья печень. Бульон сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве 30 мин.
· Среда Вильсона-Блера. Готовят из мясо-пептонногоагара, к которому добавляют глюкозу, хлористое железо, Na2SO3. На этой среде анаэробные микроорганизмы, например, возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции растут в глубине агара.
· Метод Вейон-Виньяла. Расплавленный в пробирке и охлажденный питательный агар засевают исследуемым материалом, перемешивают и натягивают его в пипетку Пастера. После застывания запаивают пипетку с обоих концов или заливают парафином и помещают в термостат. Внутри трубки развиваются отдельные колонии анаэробов.
3. Создание вакуума в анаэростатах. Из анаэростата вакуумным насосом откачивается воздух. Пробирки и чашки Петри с анаэробными микроорганизмами сразу после посева помещают в анаэростат. Колонии растут на поверхности плотной питательной среды.
Химический метод:
1. Метод Аристовского. Материал засевают на среду в чашки Петри и помещают в эксикатор, надно которого кладут химический поглотитель кислорода гидросульфит натрия или пирогаллол. Прибор помещают в термостат на 24-48 ч.
Биологический метод:
1.Метод Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем питательный агар. Когда агар застынет посредине чашки, скальпелем вырезают бороздку шириной 1-1.5 см. затем одну половину среды засевают культурой аэроба, а другую - анаэробной культурой (аэробы, поглощая необходимый для их жизни кислород, создают условия, благоприятные для развития анаэробов). Щель между дном и крышкой чашки промазывают вакуумной смазкой или заливают парафином. Чашку помещают в термостат.
Задание № 22.
Серологический метод исследования сибирской язвы (реакция Асколи)
Эталон ответа:
Для обнаружения сибиреязвенного антигена в трупном материале, кожевенном и меховом сырье, изделиях из них используют реакцию термопреципитации по Асколи. Исследуемый материал (кусочки органов, шерсти, меха, кожи) измельчают, заливают 10- 20 кратным объемом изотонического раствора натрия хлорида и кипятят в течение 10-15 мин, после чего фильтруют до полной прозрачности. Фильтрат используют в качестве антигена, наслаивая его в количестве 0,2 мл на предварительно внесенную в узкую пробирку сибиреязвенную преципитирующую сыворотку (0,2мл). Положительная реакция сопровождается появлением преципитата в виде белого кольца в месте соприкосновения антигена и сыворотки в течение 1-5 мин. При появлении преципитата спустя 10 мин реакцию считают неспецифической.
Задание №23.
Возбудитель сибирской язвы - это грамположительная бацилла, которая способна создавать капсулу в тканях микроорганизма. Какими методами следует окрашивать препарат, изготовленный из гноя карбункула больного, для определения бактерий и для определения капсулы возбудителя.
Эталон ответа:
Для определения бактерий материал от больного (содержимое карбункула, мокрота, рвотные массы, испражнения) окрашивают по Граму. В мазках сибиреязвенные бактерии располагаются короткими цепочками или попарно, концы, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. Для определения капсул используют окраску по методу Гинса (обнаруживаются обычно в крови при септической форме заболевания). Окраску мазков производят также раствором Ребигера-капсулы окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, бактерии в темно-фиолетовый. Также наличие капсул можно обнаружить при окраске препарата по Ольту. Для этого фиксированный на пламени мазок окрашивают при подогревании в течение 1—2 минут свежеприготовленным профильтрованным 2% сафранином, растворенным в горячей воде. В поле зрения микроскопа видно тело микроба, окрашенное в коричнево-красный цвет, окружающая его капсула бледно-желтого цвета. Используют способ Романовского — Гимза. Бациллы будут темно-синие, капсулы розовые.
Задание №24.
Поставьте реакцию преципитации в геле с целью определения токсигенности возбудителя дифтерии.
Эталон ответа:
Способность бактерий дифтерии продуцировать токсин устанавливают в реакции преципитации в агаре (по Оухтерлони). Для этого в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15-20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03% цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Перпендикулярно полоске штрихами подсевают исследуемые культуры. В качестве контроля используют культуру заведомо токсигенного штамма. Посевы инкубируют в термостате до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения токсина с антитоксической сывороткой в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий-усиков, что свидетельствует о встрече антигена (токсина) и антител (антитоксической сыворотки).
Задание № 25
Изготовили несколько мазков: мазок – отпечаток из пораженной ткани, мазок из агаровой культуры стафилококка, мазок из бульонной культуры стрептококка , мазок из агаровой культуры клебсиелл , мазок из гноя.
Какие мазки нужно зафиксировать химическим методом?
Какие фиксаторы можно использовать?
Эталон ответа:
Мазок отпечаток из пораженной ткани. Этот препарат фиксируется спиртом, промывается осторожно проточной водой, высушивается, окрашивается и микроскопируется.
В мазках из агаровой культур рекомендуется фиксировать метиловым спиртом.
(Мазок из бульонной культуры стрептококка фиксируют на пламени, проводя 3-4 раза тыльной стороной стекла (мазком вверх) через пламя горелки. При фиксации микроорганизмы погибают и прикрепляются к стеклу. Мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые.)
(Мазок из гноя фиксируют над пламенем .)
Для фиксации мазков химическим способом применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40 % формалин 5 мл, этиловый спирт 96° — 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе,
Задание № 26
Алгоритм изготовления простых питательных сред (МПБ,МПА).
При каких условиях стерилизуют МПА и МПБ?
Подготовка посуды, в которую разливают питательные среды.
Эталон ответа:
Приготовление мясо — пептонного бульона (МПБ)
Первый этап- получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством холодной водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. Затем мясной настой вместе с мясом кипятят в течение 1 часа, после чего остужают, фильтруют через бумажный фильтр, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1атм. 30 минут.
Второй этап- к мясной воде прибавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлорида натрия, кипятят, устанавливают рH 20 % раствором едкого натра. (гидроксид натрия)
Приготовление мясо — пептонного агара (МПА)
К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют.
МПБ стерилизуют 15-20 минут при температуре +1200С. Если после стерилизации в бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичная стерилизация производится при более низкой температуре, чем предшествующая, для предотвращения выпадения осадка.
МПА стерилизуют в автоклаве при температуре +1200С в течение 20 минут.
Подготовка посуды.
Посуду перед употреблением нужно прокипятить с кислотой, для этого ее помешают в эмалированное ведро и заливают горячей водой с добавлением 15—20 мл крепкой серной кислоты. Посуду кипятят в течение, после чего тщательно моют и сушат. Помимо мойки, вся посуда, употребляемая для микробиологической работы, должна быть простерилизованна паром под давлением в автоклаве. Чистые высушенные чашки Петри завертывают по две в оберточную бумагу и затем стерилизуют. Пастеровские пипетки завертывают в один пакет по 4—5 пипеток, также отмечая верхний конец. Пробирки, бутылки и колбы перед стерилизацией закрывают ватными пробками из не обезжиренной ваты. Питательные среды разливают в стерилизованную посуду и стерилизуют в автоклаве, Для этого после розлива питательной среды горлышки бутылок и колб завертывают плотной бумагой и завязывают.
Задание № 27
Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.
По каким признакам характеризуют колонии микроорганизмов?
Охарактеризуйте бактериальную колонию на пластинчатом агаре и пересейте ее на скошенный агар.
Эталон ответа:
На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения, либо осадка.
На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и являются наиболее существенной особенностью роста многих микроорганизмов на плотном субстрате.
При описании колонии учитывают следующие признаки :
форму колонии — округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т. д.
размер (диаметр) колонии измеряют в миллиметрах .
поверхность колонии — гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;
профиль колонии — плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т. д.
блеск и прозрачность — колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;
цвет колонии — бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная — белая, желтая, золотистая.
В правой руке, держат петлю, предварительно прокаленную в пламени горелки и охлажденную, с взятым для посева материалом. Пробирку держат между большими указательным пальцами левой руки так, чтобы ее основание находилось на поверхности кисти. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают из пробирки пробку, держа ее за наружный конец.Пробку вынимают над пламенем горелки, после чего обжигают ее края. Затем вводят петлю с материалом для посева в пробирку до дна и делают посев или на поверхность питательной среды.Пересев культуры из одной пробирки в другую осуществляется аналогично. Только в левую руку берут сразу две пробирки, а затем правой рукой (мизинцем и безымянным пальцем) вынимают сразу две пробки. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37 °С.
Задание № 28
Больной, который работает на животноводческой ферме , обратился к врачу с жалобами на плохое самочувствие. Болеет примерно месяц. Учитывая специфичность роботы больного и соответствующие клинические симптомы, врач заподозрил у него бруцеллез.
А)какой материал используют для серологической диагностики бруцеллеза?
Б)на чем основывается серологический метод диагностики?
В)какие реакции можно использовать для серологической диагностики бруцеллеза?
Г)поставьте реакцию Хеддлсона для ускоренной диагностики бруцеллеза.
Эталон ответа:
А)Используют материал кровь, моча, грудное молоко, аспираты костного мозга и биопсийный материал печени.
Б) Серологические реакции основываются на обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.
В) Серологические методы включают реакции Хеддельсона, Райта, Кумбса, связывания комплемента (РСК), пассивной или непрямой гемагглютинации (РПГА), реакция иммуноферментного анализа (РИФА), иммунофлюоресценции.
Г) Для постановки реакции Хеддлсона берут из пальца около 1 мл крови, отстоявшаяся сыворотка должна быть совершенно прозрачной. Приготавливают пластинку оконного стекла, тщательно обезжиренную спиртом и разграфленную на 6 квадратов. Сыворотку крови больного наливают при помощи градуированной пипетки в центр каждого квадрата в следующих количествах: 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 мл. К каждой из этих сывороток добавляют по одной капле антигена Хеддлсона (убитая культура бруцелл, подкрашенная метиленовым синим). Затем сыворотку, начиная с минимальных доз, смешивают с антигеном стеклянной палочкой. Контроль агглютинирующих, свойств сыворотки ставят в пятом квадрате (0,03 мл сыворотки и 0,03 мл изотонического раствора хлорида натрия), а контроль антигена — в шестом квадрате (0,03 мл антигена и 0,03 мл изотонического раствора хлорида натрия). Далее стекло равномерно подогревают в течение 2 мин. над пламенем спиртовки. Если реакция положительна, то уже через 6—8 мин. в каплях сыворотки, к которым был добавлен диагностикум, появляются хлопья, окрашенные в синий цвет.
Задание № 29
Изготовить мазок из агаровой культуры Bacillus subtilis,зафиксировать и покрасить по методу Грамма.
Подготовить микроскоп,рассматреть препарат,опредилить форму и цвет бактериальних клеток.
Эталон ответа:
А )
1. На предметном стекле готовят фиксированный мазок исследуемой чистой культуры;
2. Мазок окрашивают красителем генцианвиолетом через полоску фильтровальной бумаги. Можно также использовать заранее приготовленные фильтровальные бумажки, смоченные 1 %-ным спиртовым раствором кристаллвиолета и высушенные (метод Грама в модификации А.В. Синева). Окраску препарата проводят в течение 2…3 мин;
3. Фильтровальную бумагу снимают с мазка, краску сливают и наносят на мазок раствор Люголя на 2 мин;
4. Раствор Люголя сливают с мазка и обрабатывают 96 %-нам спиртом в течение 30…60 сек. Затем препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой;
5. Мазок окрашивают красителем фуксином 2…3 мин, второй раз промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.
Затем на стекло наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом х90 или х100 при максимальном освещении.
Б) Вегетативные клетки хорошо адсорбируют красители на своей поверхности и полностью окрашиваются. Оболочка споры малопроницаема, краски в них почти не проникают и под микроскопом споры имеют вид округлых или овальных блестящих зерен.
У бацилл размер споры не превышает ширину клетки и поэтому при образовании споры форма клетки не меняется.Споры овальные, не превышающие размер клетки, расположены центрально. Перитрихиальное расположение жгутиков, подвижная.
Задание № 30
Объяснить принцип постановки несерологической реакции гемагглютинации для диагностики гриппа .Для чего ее используют ?Как оценить результат?
Эталон ответа:
Диагностика гриппа базируется на выявлении возрастания титра противогриппозных антител в динамике заболевания или на определении специфических иммуноглобулинов класса М.В процессе серологического исследования сывороток крови в РТГА используют их последовательные (начиная с 1:10) двукратные разведения на изотоническом растворе натрия хлорида, диагностикумы вирусов гриппа А(Н1N1), A(H3N2) и В в рабочем разведении 4 ГАЕ в 25 мкл, а также взвесь эритроцитов петуха или человека с группой крови 0 в концентрации 0,4-0,5% (соотношение объемов перечисленных компонентов РТГА 1:1:2). При отдельном определении антител класса М сыворотку крови больного предварительно разделяют на 2 порции, одну из которых сохраняют до постановки определенной серологической реакции, а другую обрабатывают для разрушения макроглобулинов класса М физическими или химическими методами. Один из них - прогревание порции сыворотки при 60 °С на протяжении 30 мин, второй - обработка порции сыворотки 2-меркаптоэтанолом. После этого обе порции исследуют в РТГА.
Задание № 31
В микробиологическую лабораторию для исследования доставлен перитонеальный экссудат:
А) приготовить мазок;
Б) покрасить препарат по методу Грама;
В) провести микроскопию и охарактеризовать микрофлору перитонеального экссудата
Эталон ответа:
Экссудат – это жидкость воспалительного происхождения. Он может скапливаться в грудной полости – это плевральная жидкость, в брюшной полости – это асцитическая жидкость, в перикардиальной полости – перикардиальная жидкость.
Задание № 32
При постановке развернутой реакции агглютинации (реакции Райта) с целью серологической диагностики бруцеллёза сыворотку разводили от 1:50 до 1:1600.
Определите титр сыворотки, если в пробирке КС – прозрачная жидкость, в КА – мутность, в 1-й и 2-й пробирках осадок имеет оценку на +++, в 3-й на ++, в 5-й +, в 6-й – осадка нет.
Эталон ответа:
Реакцию агглютинации проводят для определения серогруппы, серовара микроорганизмов. Ингредиенты последовательно разливают по пробиркам. Сыворотку разводят 2-кратно (1:100 1:200 1:400 и т.д.) В каждую пробирку по 1-2 капли антигена, встряхнуть пробирки и поставить в термостат на 2 ч. при t=37. После этого предварительно учитывают результат реакции начиная с контроля (сыворотка и антиген). Отсутствие в контроле и наличие хлопьев в опытных пробирках означает положительную реакцию. После пробирки оставляют на 18-20 ч. при комнатной температуре. Чем меньше микроорганизмов агглютинировалось, тем мутнее жидкость и тем меньше хлопьевидный осадок на дне (+++, ++, +). При отрицательной реакции(-) осадка нет, взвесь остается равномерно мутной и по виду неотличима от содержимого пробирки с контролем антигена. При полной агглютинации (++++) жидкость совершенно прозрачная, а на дне пробирки осадок из хлопьев склеивающихся микроорганизмов.
Задание № 33
Охарактеризовать культуральные и ферментативные свойства микроорганизмов на среде Эндо. Приготовить из них мазок, покрасить по Граму, определить морфологию и тинкториальные свойства.
Эталон ответа:
Среда Эндо предназначена для выделения энтеробактерий, обнаружения эшерихий. Состоит из питательного агара, 1% лактозы и индикатора – основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском; лактозоотрицательные кишечные палочки образуют бесцветные колонии.
Escherichia coli – грамотрицательная палочка длиной 0,5 – 2 мкм с закругленными концами, подвижна (перетрих), спор не образует, некоторые эшерихии имеют капсулу.
Задание № 34
Провести заражение куриного эмбриона материалом, полученным от больного гриппом. Объяснить способ получения вирусудерживающего материала для подтверждения диагноза заболевания гриппом.
Эталон ответа:
В куриных эмбрионах могут размножаться вирусы, так как здесь имеются 4 субстрата для вируса: амнион, аллантоис, хориоалантоисная мембрана и желточный мешок. Поверхность скорлупы дезинфицируют 70% спиртом, выжигают огнем, смазывают 2% йодом и еще раз прожигают. Яйцо помещают вертикально, тупым концом вверх. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы, в шприц набирают 0,2 мл вирусного материала, вводят, прокалывают хориональную оболочку и погружают иглу в аллантоисную полость (примерно на 15 мм), вводят материал, место инъекции протирают йодом, затем заклеивают лейкопластырем или заливают парафином. Инкубируют 75 часов при температуре 32 градуса. Затем стерильными ножницами срезают скорлупу по границе восдушной полости. Яйцо слегка наклоняют и шприцом отсасывают аллантоисную жидкость.
Задание № 35
В микробиологической лаборатории для бактериоскопического исследования на сифилис взяли материал с твердого шанкра:
А) приготовить препарат «раздавленная» капля;
Б) какой метод используется для микроскопии такого препарата?
В) охарактеризуйте морфологические признаки возбудителя сифилиса.
Эталон ответа:
Каплю отделяемого из твердого шанкра набирают в пастеровскую пипетку, наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом в темном поле зрения. Трепонемы имеют вид тонкой светлой подвижной спирали на темном фоне.
При необходимости применяют окраску препарата по Романовскому – Гимза. Окрашивается трепонема в бледно-розовый цвет.
Используют также метод серебрения. В препарате трепонема имеет вид черной спирали на светлом фоне.
Морфология: Treponema pallidum – имеет вид тонких, нежных спиралевидных нитей с равномерными узкими и крутыми завитками. Конусообразные концы спирохеты представляют собой органеллы, с помощью которых она прикрепляется к клеткам макроорганизма. Способны образовывать L-формы.
Задание № 36
Как определить гемолитические свойства микроорганизмов?
Определите гемолитические свойства стрептококка на кровяном агаре.
Эталон ответа:
Кровяной агар – питательная среда для выявления гемолитических свойств бактерий. К расплавленному остуженному до ( 45 – 50 градусов С) питательному агару асептически добавляют 5-10% дефибринированной крови, хорошо перемешивают и сразу же разливают в чашки Петри. Вокруг выросших колоний отчетливо видны прозрачные зоны гемолиза.
По картине гемолиза на кровяном агаре стрептококки делят на 3 группы. В-гемолитические стрептококки вызывают полный лизис эритроцитов, наблюдаемый в виде полного просветления среды вокруг колонии. А-гемолитические или «зеленящие» стрептококки вызывают частичный гемолиз и образуют колонии, окруженные зоной зеленоватого оттенка, что обусловлено превращением гемоглобина в метгемоглобин. Третью группу составляют стрептококки, не вызывающие гемолиза на кровяном агаре.
Задание № 43
При микроскопии препарата, изготовленного из бульонной культуры, обнаружили грамположительные кокки и грамотрицательные палочки. Какими методами можно воспользоваться для разделения этих видов бактерий?
Эталон ответа:
Для разделения этих видов бактерий используют метод окраски по Граму. Это метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки, а именно, по наличию пептидогликанов.
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму используют анилиновые красители(это органические соединения, образующиеся при окислении анилина или его солей) : генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином микроорганизмы не изменяют первоначально фиолетовый цвет.
Грамотрицательные микроорганизмы образуют с основными красителями легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Техника проведения окраски:
1. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу, пропитанную генциановым фиолетовым.
2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя на 2 минуты.
3. Раствор сливают, мазок прополаскивают (30с)96° этиловым спиртом, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой.
4. Тщательно промывают стекла дистиллированной водой.
5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином .
6. Сливают краску, высушивают на воздухе, остатки жидкости аккуратно удаляют кончиком фильтровальной бумагой.
Задание № 44
Какие методы используют для лабораторной диагностики менингококковой инфекции? Какой материал используется? Какие питательные среды используются для выделения чистой культуры Neisseria meningitidis?
Эталон ответа:
Методы, которые используют для лабораторной диагностики менингококковой инфекции: бактериоскопические (окраска по Граму, окраска по Леффлеру), серологические (реакция преципитации, реакция связывания комплемента).
Материал для исследования: спинномозговая жидкость, кровь, смыв с носоглотки.
На обычных питательных средах Neisseria meningitidis не растут. Необходима среда с добавлением сыворотки крови или спинномозговой жидкости человека. На плотных питательных средах образует нежные прозрачные колонии; на сывороточном бульоне – диффузное помутнение и осадок.
Задание № 45
Алгоритм приготовления среды Эндо. К каким средам ее относят по консистенции и назначению? Сделать посев испражнений петлей на среду Эндо.
Эталон ответа:
Среду Эндо относят к специальным плотным дифференциально-диагностическим средам, которые используются для изучения биохимических свойств микроорганизмов и их ферментативной активности.
Применяется при исследованиях на сальмонеллы и патогенные серотипы кишечной палочки.
Основу состава среды Эндо составляет МПА к котором прибавляют глюкозу, раствор фуксина и сернистокислый натрий. Все тщательно перемешивают (до полного растворения), кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда Эндо имеет бледо-розовый цвет, хранить ее нужно в холодильнике, чашка Петри должна быть обернута бумагой.
Среду Эндо готовят в день ее использования. Среда Эндо может быть приготовлена из сухой готовой среды.
Задание № 46
Что такое биологический метод диагностики инфекционных болезней? В каких случаях его используют? Продемонстрируйте внутрибрюшинный (интраперитонеальный) способ заражения белой мыши.
Эталон ответа:
Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследу-емом материале и на обнаружение возбудителя. Методы включают заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры возбудителя, либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных -- важный этап изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внут-ривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели -- кровь, кусочки раз-личных органон, СМЖ, экссудат из различных полостей.
При внутрибрюшинном заражении животное фиксируют головой в низ, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота делают прокол кожи, удерживая иглу под острым углом, затем переводят шприц в положение, перпендикулярное к брюшной стенке, толчкообразным движением прокалывают брюшину и вводят содержимое шприца
Задание № 47
Подготовить к стерилизации пипетки, чашки Петри, пробирки флаконы. Указать условия стерилизации.
Эталон ответа:
Лабораторную посуду стерилизуют:
а) сухим жаром при температуре 180°С и 160°С соответственно 1 ч и 150 минут.
б) в автоклаве при давлении 1,5 атм. в течение 60 минут, для уничтожения споровой микрофлоры – 90 минут при 2 атм.
Вся посуда должна быть тщательно вымыта, высушена.
Чашки Петри заворачивают в бумагу по одной или несколько штук.
Флаконы закрывают ватно-марлевыми пробками, сверху закрывают бумагой и обворачивают нитью (бумажный колпачок).
Пробирки 15-20 штук обертывают бумагой.
Пипетки: перед стерилизацией для каждой пипетки готовят бактериальный фильтр (в верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в окружающую среду) и стерилизуют в железных пеналах, край которых завернут бумагой и зафиксирован нитью.
Стерилизуют 1час при температуре 160-165 градусов. Дверцу шкафа не открывают, пока не остынет. При резком падении температуры возможно образование трещин на посуде.
Задание № 48
Дайте характеристику препарата «Сыворотка противодифтерийная». Как ее необходимо вводить, чтобы избежать развития анафилактического шока?
Эталон ответа:
Сыворотка противодифтерийная.
Содержит специфические иммуноглобулины белковая фракция сыворотки крови гипериммунизированных дифтерийным анатоксином лошадей; очищенная и концентрированная методом пептического переваривания и солевого фракционирования. Представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую бесцветную или с желтоватым оттенком жидкость без осадка.
Для предотвращения развития анафилактического шока инъекцию проводят пометоду Безредко: для определения индивидуальной чувствительности первоначально вводят 0,1 мл разведенной (1:100) сыворотки внутрикожно. Через 20 мин. оценивают размеры папулы: если она менее 1 см в диаметре, то проба считается отрицательной, если более — положительной. При отрицательной пробе вводят десенсибилизирующую дозу — подкожно 0,5 мл, а лечебную дозу (100000—200000 ME) вводят через 0,5—1 час.
Завдання №49
Зробити облік результатів посіву ентеробактерій на серодовищах Гісса.
Зробити посів на МПБ з метою визначення протеолітичних ферментів.
Эталон ответа:
Среда Гисса,содержит 1% вуглевод и 1% индикатор Андреде,в состав котрого входит фуксин.Приготовленный реактив имеет соломенно-желтый цвет,в кислой среде дает покраснение. На этой среде выявляют разложение углеводов микроорганизмами.Среду разливают по пробиркам с поплавками. При наличии газа поплавок всплывает.При ферментации бактериями углеводов с образованием кислоты цвет среды меняется за счет находящегося в ней индикатора ,что создает впечетление пестроты-«пестрый ряд».Подбирают среды с соответствующими углеводами(глюкоза,мальтоза,лактоза,сахароза и др.),в процессе ферментации которых образуються кислоты и газообразные продукты.
Смотреть робочую тетрадь ст.18.
Завдання №50
Дайте характеристику препарату «Сироватка протиправцева».Як її треба вводити,щоб запобігти розвитку анафілактичного шоку?
Эталон ответа:
Торговое название препарат
Сыворотка противостолбнячная лошадиная очищенная концентрированная жидкая
Лекарственная форма
раствор для внутримышечного и подкожного введения 3000 МЕ (1доза) в комплекте с сывороткой лошадиной очищенной разведённой 1:100
Состав
В 1 мл содержится:
Активное вещество: не менее 1200 международных единиц (МЕ)антитоксина.Вспомогательно вещество: Консервант – хлороформ(0,1 %).
Описание
Прозрачная или слегка опалесцирующая бесцветная или с желтоватым оттенком жидкость без осадка.
Фармакотерапевтическая группа
Иммунные сыворотки
Фармакологические свойства
Сыворотка противостолбнячная лошадиная очищенная концентрированная жидкая (ПСС) представляет собой содержащую специфические иммуноглобулины белковую фракцию сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных столбнячным анатоксином или токсином, очищенную и концентрированную одним из методов пептического переваривания.
Препарат содержит антитоксины, нейтрализующие столбнячный токсин.
Показания к применению
Лечение и экстренная специфическая профилактика столбняка.
При подтверждении диагноза столбняка необходимо вводить противостолбнячную сыворотку по Безредко: для определения индивидуальной чуствительности первоначально вводят 0,1 мл разведенной (1:100) сыворотки внутрикожно. Через 20 мин. оценивают размеры папулы: если она менее 1 см в диаметре, то проба считается отрицательной, если более — положительной. При отрицательной пробе вводят десенсибилизирующую дозу — подкожно 0,5 мл, а лечебную дозу (100000—200000 ME) вводят через 0,5—1 час.
Завдання №51
Проведіть посів за методом Фортнера.У чому сутність біологічного методу культивування облігатних анаеробів?
Эталон ответа: