Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента (РСК)– это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая, 2-ая – гемолитическая система.
Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается, поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система.
РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний.РСК также используется для сероидентификации.
Компоненты РСК.
1. Антиген– экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым).
2. Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации).
3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции.
4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антителак эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана.
5. Комплемент– свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная).
6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.
Постановка РСК.
Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56°С в течение 30 мин.
РСК проводят в 2 фазы.
I фаза – специфическая: в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37°С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин.
II фаза – индикаторная: в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин.
Учет результатов РСКпроводятпри безупречных результатах в контролях.
Положительная реакция(человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект– образование осадка эритроцитов.
Отрицательная реакция(человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь".
В диагностике инфекционных заболеваний также используютсяреакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).
Лекция № 17
Иммунобиологические медицинские препараты.
Иммунобиологические препараты (ИМП) – это препараты, которые оказывают влияние на иммунную систему или действие которых основано на иммунологических реакциях.
Эти препараты применяют для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболеваний и тех неинфекционных заболеваний, в развитии которых участвует иммунная система.
К иммунобиологическим препаратам относят:
1. Вакцины и другие (анатоксины, фаги, эубиотики) лечебные и профилактические препараты из живых микробов или микробных продуктов.
2. Иммунные сывороточные препараты.
3. Иммуномодуляторы.
4. Диагностические препараты, в том числе аллергены.
ИМП применяют для активации, подавления или нормализации деятельности иммунной системы.
Вакцины.
Вакцины – это препараты для создания активного искусственно приобретенного иммунитета. Вакцины применяют для профилактики, реже – для лечения заболеваний.
Действующее начало вакцин – специфический антиген.
Классификация вакцин:
1. Живые вакцины:
- аттенуированные (ослабленные);
- дивергентные;
- векторные рекомбинантные.
2. Неживые вакцины:
- молекулярные;
- корпускулярные: а) цельноклеточные и цельновирионные; б) субклеточные и субвирионные; в) синтетические, полусинтетические.
3. Ассоциированные вакцины.
Характеристика живых вакцин.
Живые аттенуированные вакцины – препараты из ослабленных микробов, потерявших вирулентность, но сохранивших иммуногенность. Ослабленные микробы – это вакцинные штаммы.
Способы получения вакцинных штаммов:
а) метод отбора мутантов с ослабленной вирулентностью;
б) метод направленного (искусственного) снижения вирулентности (выращивание на неблагоприятных питательных средах, длительное пассирование (последовательное заражение) через организм маловоспримчивых лабораторных животных);
в) метод генной инженерии (инактивация гена, который отвечает за образование факторов вирулентности патогенных микробов).
Вакцинные штаммы микробов сохраняют способность размножаться в месте введения и распространяться по организму. В результате этого возникает вакцинная инфекция (заболевание протекает в легкой форме). Вакцинная инфекция всегда приводит к формированию иммунитета к патогенным микробам данного вида, к которым относится вакцинный штамм.
Дивергентные вакцины – препараты из живых микробов, не болезнетворных для человека, но сходных по антигенным свойствам с болезнетворными микробами. Например, для прививки против оспы человека используют вирус оспы коров.
Векторные рекомбинантные вакцины получают методом генной инженерии. Для этого в геном вакцинного штамма встраивают ген (вектор), контролирующий образование антигенов другого возбудителя (чужеродного антигена). Например, в штамм вируса оспенной вакцины встраивают антиген вируса гепатита В(HBs – антиген). Такая векторная вакцина создает иммунитет и против оспы и против гепатита В.
Получение живых вакцин:
1) выращивают вакцинный штамм в асептических условиях на оптимальной питательной среде;
2)биомассу микробов концентрируют, стандартизуют (определяют титр – количество микробов в 1мл), добавляют стабилизатор (сахарозожелатиновый агар, человеческий альбумин), который защищает антигены от разрушения, лиофильно высушивают, фасуют в стерильные ампулы или флаконы.
После получения вакцины проходят государственный контроль – проверяется реактогенность, безвредность и иммуногенность.
Преимущества живых вакцин:
1) создание прочного (напряженного) и длительного иммунитета (5-7 лет);
2) прививки делают однократно более простыми способами (перорально, интраназально, накожно, подкожно);
3) менее реактогенны, т.к. не содержат консервантов и адъювантов.
Недостатки живых вакцин:
1) трудоемкость получения вакцинных штаммов;
2) малый срок хранения (1 – 2 года);
3) хранение и транспортировка при пониженной температуре (+4°С - +8°С).
Для обеспечения безопасности живых вакцин необходимо проводить постоянный контроль реверсии вирулентности возбудителя, строго соблюдать требования, обеспечивающие сохранность и активность вакцинных микробов.
Примеры живых вакцин:
1) бактериальные вакцины – туберкулезная (БЦЖ), чумная, туляремийная, сибиреязвенная, бруцеллезная, против Ку-лихорадки;
2) вирусные вакцины – полиомиелитная, коревая, гриппозная, паротитная, против желтой лихорадки.
Характеристика неживых вакцин.
Корпускулярные вакцины – препараты из инактивированных культур патогенных (высоко вирулентных) или вакцинных штаммов бактерий и вирусов. Способы инактивирования: 1) физические: температура, УФ-лучи, ионизирующее излучение; 2) химические – формалин, спирт, ацетон, b-пропиолактон.
Корпускулярные вакцины из целых бактерий называют цельноклеточными, а из целых (неразрушенных) вирусов – цельновирионными.
Получение корпускулярных вакцин:
1) выращивают в асептических условиях чистую культуру микробов;
2) проводят инактивацию в оптимальном режиме (нужно лишить микроорганизмы жизнеспособности, но сохранить их иммуногенность), например, гретые вакцины инактивируют путем прогревания взвеси микробов при 56°С;
3) стандартизуют (по концентрации микробов), добавляют консервант (мертиолат, формальдегид, 2-феноксиэтанол и др.), который подавляет постороннюю микрофлору при хранении, фасуют;
Вакцины могут быть жидкие (суспензии) или сухие. Готовые вакцины подвергают контролю на стерильность, безвредность, иммуногенность, проверяют густоту вакцины или титр (количество микробов в 1 мл).
Преимущества цельноклеточных и цельновирионных вакцин:
1) простота получения;
2) большая устойчивость при хранении и более длительный срок хранения.
Недостатки цельноклеточных и цельновирионных вакцин:
1) менее прочный и продолжительный иммунитет;
2) необходимость 2-х и 3-х-кратных прививок парентеральным путем (подкожно, внутримышечно), иногда перорально;
3) реактогенность – боль, чувство жжения на месте введения, повышение температуры, судорожный синдром и т.д.
Примеры вакцин:против гриппа, коклюша, холеры, гепатита А, герпеса, вирусного энцефалита и др. Они используются для профилактики соответствующих заболеваний. Некоторые вакцины используют для лечения (вакцинотерапии) хронических инфекционных заболеваний – бруцеллеза, хронической дизентерии, хронической гонореи, хронических стафилококковых инфекций. Для лечебных целей используют и аутовакцины– препараты из убитых бактерий, выделенных из организма больного.
Корпускулярные вакцины из разрушенных бактерий и вирусов называются субклеточными и субвирионными. Такие вакцины содержат антигенные комплексы, выделенные из бактерий и вирусов после их разрушения.
Раньше эти вакцины назывались химическими. Однако этот термин более применим к вакцинам, полученным методам химического синтеза.
Получениесубклеточных и субвирионных вакцин более сложное, чем цельноклеточных и цельновирионных (например, ферментативное переваривание с последующим осаждением антигенов этиловым спиртом), но они содержат меньше баластных веществ.
Преимущества субклеточных и субвирионных вакцин:
1) содержат только иммунологически активные части клеток – антигены без других компонентов;
2) менее реактогены;
3) более стабильны и лучше подвергаются стандартизации и более точной дозировке;
4) можно вводить в больших дозах и в виде ассоциированных препаратов.
Недостатки:
1) слабая иммуногенность;
2) малые размеры, что приводит к быстрому выведению и к краткому антигенному раздражению.
Для устранения недостатков к таким вакцинам добавляют адъванты.Адъванты усиливают иммуногеность вакцин. Они укрупняют антигенные частицы, создают в месте введения "депо", из которого антигены медленно высвобождаются, что удлиняет время их воздействия на иммунную систему. В качестве адъювантов используют минеральные коллоиды( фосфат алюминия, фосфат кальция, гидрат окиси алюминия, алюмо-калиевые квасцы), полимерные вещества (липополисахариды, синтетические полимеры), растительные вещества (сапонины) и др. Вакцины с адъювантами называются адъювантными, сорбированными, адсорбированными или депонированными вакцинами.
Примеры субклеточных и субвирионных вакцин:против брюшного тифа на основе О-, Н- и Vi –антигенов, против гриппа на основе антигенов вируса (нейраминидаза и гемагглтинин), против сибирской язвы на основе капсульного антигена, проив дизентерии, менингита, холеры.
Молекулярные вакцины – это специфические антигены в молекулярной форме.
Они могут быть получены путем биосинтеза, химического синтеза и генной инженерии.
Метод биосинтеза заключается в том, что из микроба или из культуральной жидкости выделяют протективный антиген в молекулярной форме. Например, возбудители дифтерии, ботулизма, столбняка при росте синтезируют и выделяют в культуральную жидкость молекулы экзотоксинов. После обработки формалином экзотоксины теряют свои токсические свойства, но сохраняют иммуногенность.Таким образом, к типичным молекулярным вакцинам, которые получают путем биосинтеза, относятся анатоксины.
Получение анатоксинов:
1) выращивают возбудителей, которые образуют экзотоксины (возбудители столбняка, ботулизма, дифтерии, газовой гангрены), глубинным способом в жидкой питательной среде, в результате этого в культуральной жидкости накапливается экзотоксин;
2) отделяют микробные клетки от культуральной жидкости путем фильтрации через бактериальные фильтры;
3) добавляют к культуральной жидкости, в которой находится экзотоксин, 0,4% формалин и выдерживают при 37°С в течение 3 – 4 недель;
4) анатоксин очищают, концентрируют, стандартизуют – определяют активность анатоксина, добавляют консервант и адъювант и фасуют. Такие анатоксины называют очищенными сорбированными.
Активность анатоксина выражают в антигенных единицах : единицах связывания (ЕС) или единицах флоккуляции (ЛФ).
1 ЛФ – это то количество анатоксина, которое с 1 МЕ антитоксической сыворотки дает начальную реакцию флокулляции.
Титр анатоксина – это содержание ЛФ в 1 мл вакцины.