Совместная работа студента с преподавателем

Далее ⇒

Лабораторная работа № 6

Изучение микроморфологических особенностей продуцентов биологически активных веществ (на примере продуцента омомицина Streptomyces chromopurpureos) на разных стадиях культивирования (трофофаза, идиофаза) с выбором оптимальных условий процесса биосинтеза антибиотика

Занятие № 13

Тема занятия: Изучение микроморфологических особенностей продуцентов биологически активных веществ (на примере продуцента омомицина Streptomyces chromopurpureos) на разных стадиях культивирования (трофофаза, идиофаза) с выбором оптимальных условий процесса биосинтеза антибиотика

Цель работы:научиться определять стадии роста и биосинтеза продуцента, т.е. определять трофофазу и идиофазу методом микроскопирования окрашенного мазка культуральной жидкости.

Задачи обучения:

· Научиться идентифицировать микроморфологические признаки продуцента в стадии роста (трофофаза) после окраски метиленовой синью;

· Научиться идентифицировать признаки продуцента в стадии биосинтеза (идиофаза);

· Уметь сравнить микроскопию двух фаз – интенсивность окраски, вид и размер клетки, наличие внутриклеточных включений, дифференциацию протоплазмы, образование спор;

· Уметь измерять объемную биомассу на разных стадиях культивирования продуцента и построить кривую роста.

Материальное обеспечение работы (Материалы и приборы)

· культуральная жидкость продуцента омомицина;

· метиленовая синь;

· предметные стекла;

· пипетки стеклянные;

· фильтровальная бумага;

· пробирки мерные.

· микроскоп;

· осветитель к микроскопу;

· центрифуга;

· газовая горелка.

Задание № 1.Исследовать динамику кривой роста продуцента с определением стадий процесса биосинтеза и сравнительной характеристикой цитохимических признаков продуцента в трофофазе и идиофазе.

Методика выполнения работы (порядок выполнения работы)

· Отбирают пробы культуральной жидкости из колбы при ее одновременном перемешивании, что позволяет отобрать среднюю пробу.

· Переносят отобранную культуральную жидкость в мерную пробирку до отметки 10 мл.

· Уравновешивают пробирки с отобранными пробами на весах.

· Центрифугирируют пробирки с отобранными пробами культуральной жидкости при 2000 об/мин в течение 10 мин. Пробирки извлекают из центрифуги только после окончательной остановки ротора.

· Определяют процентное содержание биомассы относительно всего содержимого пробирки (в начальной стадии возможно неполное исчерпание питательной среды и как результат присутствие в осадке нерастворимых компонентов среды вместе с биомассой).Отличить биомассу от компонентов среды помогает преподаватель.

· На основе полученных данных строят график; по оси абсцисс указывается время взятия пробы, по оси ординат – количество образовавшейся биомассы.

· Из колб с культуральной жидкостью с пометкой «48 ч роста» и «168 ч» роста отбирают пипеткой пробы, переносят на предметные стекла и растирают по их поверхности.

· Пробу культуральной жидкости на стекле сушат на воздухе или в пламени горелки так, чтобы стекло не перегревалось. Перегрев культуральной жидкости приведет к деформации клеток продуцента и нарушит цитологическую картину при микроскопировании.

· Высохшую пробу культуральной жидкости на стекле фиксируют в пламени горелки, направляя стекло в пламя со стороны нанесенной пробы. Проводят трижды стекло через пламя медленными движениями, после чего стекло остужают при комнатной температуре.

· Остуженное предметное стекло с нанесенной пробой помещают на специальную полочку над кристаллизатором и окрашивают метиленовой синью, нанося краситель на всю поверхность мазка и выдержав 30-60 с. По окончании окраски излишек красителя сливают на фильтровальную бумагу и промывают стекло под тонкой струей воды, при этом проба на стекле должна быть расположена с обратной стороны от струи воды и омываться лишь стекающими каплями. Промывку осуществляют до обесцвечивания стекающей воды, после чего излишки воды промокают фильтровальной бумагой, устанавливая стекло ребром. Сушат стекла на воздухе или в пламени горелки, не допуская перегревания.

· Проводят микроскопию окрашенного мазка.

· Полученные данные фиксируют в рабочем журнале; микроскопию зарисовывают и описывают; на графике роста культуры в процессе ферментации обозначают стадии культивирования. По данным микроскопии указывают трофофазу и идиофазу.

Совместная работа студента с преподавателем

Самостоятельная работа студентами выполняется под непосредственным контролем преподавателя. После выполнения задания студенты должны представить тетради на проверку преподавателю и отдать лаборанту для обработки использованную лабораторную посуду.

Контрольные вопросы:

1. По каким микроморфологическим принзнакам идентифицируются продуценты в стадии роста (в тропофазе)?

2. По каким микроморфологическим принзнакам идентифицируются продуценты в стадии биосинтеза ( в идиофазе)?

3. По каким признакам сравнивают микроскопию двух фаз?

4. Как можно измерять объемную биомассу на разных стадиях культивирования продуцента и построить кривую роста?

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА:

1. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М.: Изд. центр «Академия», - 2008. – 208 с.

2. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию: Курс лекций. – Минск.: БГУ, 2002. - 105 с.

3. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Биотехнология: Учебное пособие. – М.: Изд. Центр «Академия». – 2006. – 256 с.

4. Орехов С.Н. Фармацевтическая биотехнология. Руководство к практическим занятиям. – Учебное пособие. – Под ред. акад. РАМН В.А. Быкова, проф. А.В Катлинского. – М. : ГЭОТАР-Медиа 2009. – 384 с.

5. Елинов Н.П. Химическая микробиология. - Учебник. - М.: Высшая школа. - 1989, 448 с

Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. - Учебное пособие. - М.: Изд-во МГУ. - 1989, 294 с.
Биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. - М.: Мир. - 1988, 480 с.
Чуешов В.И., Зайцев А.И., Шебанова С.Г. Промышленная технология лекарств. Том 2. Харьков, 2002.
Биотехнология микробного синтеза (Под ред. Бекера М.Е.) – Рига – 1980.
Биотехнология. /Отв. редактор А.А. Баев. - М.: Наука. - 1984, 310 с.
Никитин Г.А. – Биохимические основы микробиологических производств – Киев, 1981.
Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов. М., - 1979 г.
Попова Т.В. – Развитие биотехнологии в СССР – М., Наука - 1988 г.
Промышленная микробиология (Под ред. Егорова Н.С.) – М., 1989 г.
Популяционные аспекты биотехнологии – Печуркин Н.С., Брильков А.В., Маркенкова Т.В. – Новосибирск: - Наука – 1990 г.
Процессы и аппараты химической технологии (Под ред. П.Г. Романкова). – Л. – 1981.
Специальные журналы: «Биотехнология», «Фармация Казахстана», «Фармация», «Фармацевтический бюллетень», и др.

Лабораторная работа № 8.

«Определение оптимальных параметров ведения процесса биосинтеза противоопухолевого антибиотика рубомицина»

Занятие № 14

Тема занятия: Определение оптимальных параметров ведения процесса биосинтеза противоопухолевого антибиотика рубомицина

Цель: научиться анализировать параметры процесса биосинтеза БАВ и определять оптимальные параметры для биосинтеза антибиотиков и других БАВ.

Задачи обучения:

· изучить представленные в виде таблицы параметры двух процессов синтеза рубомицинаи представить данные в виде графика;

· охарактеризовать эти процессы и выбрать из них оптимальный (время начала биосинтеза, какими изменениями сопровождается процесс биосинтеза рубомицина^♠).

При описании процесса руководствоваться предложенной в примечании схемой изложения и дополнить собственными выводами.

Ферментация № 1 (аппарат «Chemap 1»)

· Состав среды, %:

· крахмал картофельный – 6,5;

· соевая мука – 1,7;

· глюкоза – 1,5;

· (NH₄)₂SO₄ – 0,4;

· K₂HPO₄ – 0,01;

· CaCO₃ - 0,5;

· pH (перед посевом) 7,1.

Таблица 5.Показатели ведения процесса в аппарате «Chemap 1» с использованием крахмальной среды

№ пробы	Часы роста	Биомасса, %	рН	Углеводы общие	Глюкоза	Азот	рО₂, %	Активность, мкг/мл
		-	7,1	6,55	1,56	86,8
			6,9	6,22	1,56	86,8
			6,9	5,98	-	84,0
			6,5	5,36	-	81,2		306,6
			7,0	4,31	-	53,2		297,3
			8,2	4,31	-	89,6

Ферментация №2 (аппарат «Сhemap 2»)

Состав среды, %:

Гороховая мука – 3;
Сахароза – 7;
NaCl – 0,4;
KCL – 0,04;
K₂ HPO₂ – 0,08;
(NH₄)₂SO₄ – 0,4;
СаСО₃ – 0,8;
рН (перед посевом) 7,41.

Таблица 6. Показатели ведения процесса в аппарате «Сhemap 2» с использованием сахарозно-гороховой муки

№ пробы	часы роста	биомасса, %	рН	углеводы общие	глюкоза	азот	рО₂,%	активность, мкг/мл
		-	7,15	5,57	0,88	114,8		50,7
			7,07	5,54	-			160,6
			6,7	4,0	-	81,2		335,8
			6,75	3,41	-			552,8
			6,75	2,32	-	8,4		685,8
			6,6	0,9	-	1,02

Порядок выполнения работы

Используя приведенные данные, построить кривые изменения для каждого параметра; по оси ординат начертить индивидуальную шкалу.
Для каждого процесса ферментации построить отдельный график.
Зависимость накопления антибиотика от изменения параметров описывают для каждого процесса после выполнения графического рисунка.
Для двух процессов сделать обобщающий вывод оптимальных изменений, ведущих к выходу максимального количества антибиотика.

Примечание: а)При характеристике процессов использовать:

Продолжительность лог-фазы ….ч, в этот период (не) наблюдается ….;
Прирост биомассы максимальный на … ч роста, фаза роста (трофофаза продолжается до … ч от начала процесса и характеризуется значением рН - …, азота - …, углеводов - …, интенсивность дыхания - …);
Начало синтеза антибиотика совпадает со снижением … ;
Биомасса на … ч, торможение прироста биомассы совпадает с … ;
Максимальная скорость биосинтеза совпадает с …

б) При выборе оптимального процесса обратить внимание на:

Далее ⇒