Сыворотка крови животных и человека
Сыворотка крови богата биологически активными соединениями, значение многих из которых в отношении микроорганизмов неясно. Она является также одним из источников железа, необходимого для многих видов бактерий. Особенности сыворотки крови разных видов животных и человека хорошо изучены. Показаны различия в белковом составе (Кармолиев Р. X., 1971) и других биохимических свойствах (Радаева И. Ф., Костина Г. А, 1998). При культивировании микобактерий для обогащения жидких питательных сред используют сыворотку крови различных видов млекопитающих. В нативном состоянии ее рекомендуют включать в среду для культивирования L—форм микобактерий туберкулеза Дорож-кова И. Р., Волк А. В. (1972) и Мордовской Г. Г., Птицына Е. А. (1982). По данным Mysak J. (1974) среда Банич с добавлением 10% сыворотки крови превосходит по культуральным свойствам среды
Левенштейна-Иенсена и Шула. Максимальное улучшение культу-ральных свойств жидких питательных сред отмечается при использовании крови (Dickinson J. et al., 1989) и сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) или V фракции бычьего сывороточного альбумина (БСА). Это среда Школьниковой с 10% сыворотки крови КРС и среда Миддлбрука (Middlebrook) без агара, но с добавлением комплекса олеин-альбумин-декстроза-каталаза. Хранение коммерческих сред, содержащих V фракцию БСА, ухудшает их культуральные свойства (Culter S., 1988). Бибергаль В. А. (1991) показала улучшение культуральных свойств среды Школьниковой в 9 раз при добавлении свежей человеческой плазмы. Можно, по ее мнению, использовать для этого и инактивированную сыворотку крови КРС. По данным Ильиных Л. А. (1990) при добавлении сыворотки крови КРС в среду Гельберга отмечается более ранний и интенсивный рост колоний микобактерий. Свежая сыворотка крови КРС в среде Middlebrook 7H11 ускоряла рост М. bovis (Galaciner J., Horwill D., 1977). Сыворотку крови КРС содержит среда Ренжа-ра для культивирования М. paratuberculosis (цит. по Сидорову М. А. и соавт., 1995). Среду для выделения микобактерий, содержащую сыворотку крови лошади, предлагают Дудницкий И. А. и соавт. (1991). Dhople A. et al. (1996) отмечают стимулирующий эффект на рост М. avium добавления в бульон 7Н9 сыворотки крови кроликов и людей, больных гемолитической анемией и гемохроматозом; тогда как сыворотки крови здоровых людей и больных микобактери-озом, вызванным М. avium, наоборот, оказывали угнетающее действие. Сыворотка крови лошади входит в состав среды ML для культивирования М. leprae (Osawa N., 1997). Среда VS3E, содержащая 30% сыворотки крови плода коровы (Bhatia V., Rao S., 1989), поддерживает рост М. leprae.
Нативную сыворотку крови лошади используют в питательных средах для пневмококков Балаян Л. Б. (1947); Бухарин О. В. и соавт. (1981).
Сыворотка крови входит в состав сред для нейссерий (Лабин-ская А. С, 1972; ГаджиеваА. Г. и соавт, 1982), в том числе менингококков (Руководство..., 1973; Шичкина В. П. и соавт., 1983). Общепринято выделение и культивирование последних на агаровых средах с 20% сыворотки крови лошади (Игонина Ю. А. и соавт., 1976; Костюкова Н. Н. и соавт., 1980). Используется и сыворотка крови КРС (авт. свид-во № 1659485, 1991). Учитывая процентное соотношение белков в асците, Андреева 3. М., Боб-ровникова А. Я. (1984) заменили его в соответствующих питательных средах для нейссерий сывороткой крови лошади. При этом, как отмечалось выше, ростовой эффект 1%-ой сыворотки объяснялся нейтрализацией ею токсического компонента агара. Шичкина В. П. и соавт. (1983) вводили в среду 13—20% сыворотки крови животных. Татарников В. М. и соавт. (1984) показали низкую высеваемость менингококка на среде Гаджиевой в сравнении с 20%-ым сывороточным агаром Хоттингера и рекоменду-
ют добавлять в среду 10% нативной сыворотки крови лошади.
Османова М. М. и соавт. (1987) на жидких средах с разным содержанием сыворотки крови КРС показали защитный и стимулирующий механизм действия ее на рост гонококков. В результате оптимизации процесса культивирования получен рост тест-штаммов в бессывороточных средах. N. meningitidis формируют поли-сахаридную капсулу на плотных средах с добавлением нативной сыворотки, белки которой, однако, являясь балластными примесями, затрудняют процессы выделения и очистки препаратов, содержащих капсульный полисахарид. Скляр Т. В. и соавт. (1997) считают возможным замену в среде для культивирования N. gonorrhoeae сыворотки крови КРС на плазмол. Сыворотка крови человека и животных улучшает рост бледных трепонем. По данным Tokahashi К. et al. (1987) сыворотки крови человека и свиней инги-бируют активность гемолизина Т. hyodysenteriae.
Сыворотка крови млекопитающих удовлетворяет пищевые потребности большей части патогенных видов микоплазм в протеине, стероле, фосфолипиде и ацетонрастворимом липиде (Каган Г. Я., Раковская И. В., 1968). Наиболее широко используются для культивирования среды, обогащенные нативной сывороткой лошади. Выявленную непригодность сыворотки крови КРС Башмакова И. А., Солдатова В. М. (1971) связывают с низким содержанием в ней холестеринов и липидов. Кроме того, по их данным сыворотка крови человека эффективнее для выделения микоплазм.
Сыворотка крови лошади используется в среде для выделения Ureaplasma urealyticum (Гаджиева Г. Р. и соавт., 1989) и в среде U-9 (Raddi M. et al., 1992). Ее содержание в средах для микоплазм колеблется от 5 до 20% (Зуев В. В., 1971; Жеверже-ева И. В. и соавт., 1983; Барышникова П. И., 1994; Sikdar A. et al., 1992).
Ferreira N. (1993) допускает при инкубации М. gallisepticum на средах ТР и SS замену лошадиной сыворотки крови свиной, хотя 1-ая для дифференциации штаммов и анализа белков в ЭПАГ оказалась предпочтительней. Билько И. П. (1975) рассматривает использование сыворотки крови в питательных средах для получения биомассы микоплазм как отрицательное явление, вследствие необходимости многократного отмывания и концентрирования ее для освобождения от белков сыворотки. Эффективной для выделения гемокультур микоплазм оказалась среда Клодницкого с 0,01 %-ым цистином без добавления сыворотки крови животных (Клодницкая С. Н., 1976). О возможности культивирования М. canadense и М. verecundum в питательной среде для микоплазм без сыворотки, но с БСА, сообщают Graciela M., Sotomayor P. (1990), хотя интенсивность роста при этом была ниже. Breard A. (1990) рекомендует синтетический заменитель сыворотки крови при молекулярно-биологических исследованиях, но не для получения антигенов у микоплазм. По данным Okasa-
ki N., Fujiwara K. (1992) отдельные виды микоплазм чувствительны к микоплазмоцидному действию сыворотки крови лошади. Наибольшая активность выявлена по отношению к М. pneumoniae. Эффект проявлялся при 37°С в присутствии Са2+ и Mg2+. После прогревания при 56°С в присутствии комплемента эффект сохранялся в отношении М. pneumoniae и М. fermentans, но не в отношении М. neurolyticum и М. laidlawii. Установлено, что эта активность определяется комлексом lg G и М.
Сыворотка кроличьей крови в концентрации 5—30% является основным компонентом питательных сред для лептоспир. Малахов Ю. А. (1992) рекомендует использовать для их культивирования сыворотку крови животных только двух видов: кроликов и овец. Сыворотки крови КРС, баранов, лошадей и свиней обладают бактерицидным действием по отношению к лептоспирам (Ананьина Ю. В., Чернуха Ю. Г., 1983; 1984). Наиболее активно росту этих микроорганизмов способствует альбуминовая фракция. Некоторые исследователи рекомендуют использовать гемо-лизированную сыворотку, отмечая улучшение роста лептоспир при определенной степени гемолиза. Сыворотка крови или альбумин используются для детоксикации твинов в питательной среде.
Первоначально в нашей стране при промышленном производстве вакцины против лептоспироза микроорганизмы культивировали в среде Уленгута, состоящей из воды и кроличьей сыворотки крови. Замена в дальнейшем этой сыворотки на овечью не снизила качества вакцины. Однако переход в 1966 году биофабрики на альбуминовую среду ВГНКИ-1, где сыворотка была заменена ее альбуминовой фракцией вызвал ухудшение антигенных свойств лептоспир и с 1975—1976 годов для культивирования вновь стали использовать водно-сывороточную среду с овечьей сывороткой. Затем было установлено отрицательное влияние на рост лептоспир спонтанно встречающихся в сыворотках крови овец-доноров гомологичных антител и на биофабрике внедрили комбинированную сывороточно-альбуминовую среду, которую применяют и в настоящее время (Ситьков В. И. и соавт., 1996). За рубежом же для этих целей используют бессывороточные полусинтетические (альбуминовые) или синтетические питательные среды.
Сыворотку крови различных видов млекопитающих добавляют в среды для спорификации патогенных и непатогенных микробов (Sementini А., 1942), в частности, В. anthracis (Srinivasan V. et al., 1972). Кровь и ее сыворотка адсорбируют ингибиторы капсу-лообразования питательной среды (Schaefer W., 1963). Роль последней в образовании капсул у вирулентных штаммов В. anthracis изучали Meynell E., Meynell G. (1964). Нативные бычья или лошадиная сыворотки в относительно высокой концентрации являются обязательными компонентами многих элективных сред, предназначенных для капсулообразования В. anthracis (ГКИ; Томова; Шляхова, 1973; Низамова Р. Н. и соавт., 1992; Лефлера; сыворо-
точных агара и бульона). Левина Е. Н. и соавт. (1974) с целью накопления токсина В. cereus использовали среду Торна с добавлением, помимо других компонентов, 1% сыворотки крови.
Кровь КРС, а чаще ее сыворотка, входят в состав питательных сред для культивирования бруцелл (Колесникова Н. С, 1961; Альтон Дж., Джонс Л., 1968). Как заменитель сыворотки для повышения ростовых качеств среды для бруцелл используют твин-40. В отличие от других (шероховатых форм) бруцелл штамм Br. ovis И-65 (гладкий вариант) растет только на питательных средах с нативными сыворотками крови КРС или лошади (Тарасова Т. А. и соавт., 1983).
Для культивирования Campylobacter pylori используют различные кровяные среды с добавлением 5—10% бараньей, лошадиной или человеческой крови и (или) сыворотки (Баженов Л. Г., 1991). Xia H. et al. (1992, 1993) отмечают, что в сердечно-мозговом бульоне с 10% лошадиной сыворотки крови С. pylori сохраняются более 3 сут. Schulze E et al. (1987) выделяли и дифференцировали бактерии рода Campylobacter на агаре Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton) с добавлением 10% телячьей крови.
Allan Е., Poxton 1. (1994) показали влияние среды культивирования на чувствительность различных видов Bacteroides к бактерицидному действию комплемента сыворотки крови человека и экспрессию поверхностных структур. Изученные штаммы были в различной степени чувствительны к сыворотке когда культивировались в обогащенной среде с протеозным пептоно-дрожже-вым экстрактом. Однако при выращивании в минимальной среде Van Tassell и Wilkins, половина штаммов проявляла ощутимую устойчивость как к человеческой, так и к инактивированной бараньей сывороткам крови.
Для культивирования возбудителя американского гнильца пчел (Вас. larvae) в настоящее время широко используют МПА с добавлением 10% лошадиной сыворотки крови без консерванта, хотя и на ней Вас. larvae не всегда хорошо растет.
Савельев Е. П. и соавт. (1989) изучали влияние на рост стрептококков группы А добавления в среду культивирования фракций сыворотки крови КРС, содержащих низкомолекулярные соединения. Griffiths В., McClain О. (1987) показали восстановление инга-бированной ионами Fe3+ продукции гемолизинов Str. pyogenes при добавлении в среду сыворотки. По данным Shimokawa О. et al. (1994) сыворотка крови лошади подавляет рост L-форм St. aureus, а редкие колонии, выраставшие на среде, обогащенной данной сывороткой, являются стабильными L-формами. Ivanova E. et al. (1991) культивировали стабильные L-формы протопластов Е. coli WE+ на соевой среде с 10% сыворотки.
По данным Evans M. et al. (1986) добавление сыворотки крови человека к бульону Мюллера-Хинтона приводит к появлению 14—50% ложноположительных результатов чувствительности Ps. aeruginosa к моксалактаму. Значительно возрастает чувствитель-
I7
ность Ps. aeruginosa к сыворотке крови человека при выращивании на Mg-дефицитной среде (Tzouvelekis L. et al., 1990).
Кравцов А. Н. и соавт. (1987, 1992) показали связь остановки роста Y. pestis в нативной сыворотке крови с ограничением поступления железа в микробную клетку. Выяснено, что гемин Y. pestis в сыворотке не используют. Предполагается ассимиляция железа трансферрина зависящая от температуры и осуществляющаяся только при 28°С. Инкубация в сыворотке крови человека способствует обогащению антигенной структуры возбудителя чумы, повышая тем самым вирулентность и иммуногенность.
Пастереллы на средах без сыворотки растут не всегда удовлетворительно, поэтому в бактериологической диагностике пасте-реллеза рекомендуется использование сывороточных МПА и МПБ, а также сывороточных бульона и агара Хоттингера в состав которых входят 10% нативной сыворотки крови лошади (Метод, указания ..., 1992).
Наличие цистиназы—основного видового признака С. dipt-heriae—определяют на среде Пизу с 10% лошадиной сыворотки. Батурина А. В. и соавт. (1990) заменили в ней лошадиную сыворотку на среду 199. Отсутствие сыворотки крови в агаровой среде не сказывается на качестве тестирования токсигенности дифтерийных культур, причем наилучшей из заменителей сыворотки (твин-40, ГЛА, аминопептид, протеин) оказалась среда 199 (Гази-зова Г. Р. и соавт., 1990).
Сидоров М. А. и соавт. (1995) отмечают лучший рост актино-мицетов A. pyogenes и A. hardeovulneris на сывороточных средах. Сыворотка крови кролика входит также в состав среды Бейгтона, Колмана (1976).
Пушкарева В. И. и соавт. (1997) показали реверсию покоящихся листерий в вегетативное состояние под воздействием фе-тальной сыворотки.
Castaneda E. et al. (1988) отмечают эффективность наличия в среде культивирования лошадиной сыворотки крови при выделении Paracoccidioides brasiliensis и объясняют это содержанием в ней сидерофоров.
Поданным Ожередовой Н. А. (1997) стимулирующий эффект сыворотки крови рыб на рост и размножение С. albicans выше, чем кроличьей.
1.5. Твины
Твины—это детергенты (поверхностно-активные вещества, которые, расщепляя молекулы белка или жира на различные соединения, проникают в жировую и казеиновую пленки). В небольших концентрациях твины обеспечивают рост культур микроорганизмов не изменяя их морфологических и биологических свойств (Карташова В. М., 1973). В то же время, имеются данные
о специфических изменениях в структуре клеточных стенок и цитоллазматических мембран у L. monocytogenes, Sal. typhimuri-um, Ps. aeruginosa и Ps. pseudomallei при обработке их 0,5 и 1% твин-20 (Cherepova N., Veljanov D., 1994).
Бруцеллы разных видов способны гидролизовать твины (Рыкова В. И., Домарадский И. В., 1963) и в качестве компонентов питательных сред для их выращивания рекомендуются твин-40 (АльтонДж., Джонс Л., 1968),твин-60(ГрушинаТ. А., 1975, 1978) и твин-80 (Бакулов И. А. и соавт., 1993) с целью замены сыворотки и повышения ростовых качеств сред.
Крылова М. Д. (1969, 1972) при культивировании Corynebacte-rium diptheria добавляла к мартеновскому бульону 0,02% твина-80. Collins (1986) рассматривает способность к гидролизу твина-80 у С. cystitidis как признак, позволяющий дифференцировать его от С. renale и С. pilosum, которые такой способностью не обладают.
Бузолева Л. С, Пручкина 3. В. (1990) для выявления липазы у бактерий кишечной группы (шигелл и сальмонелл) после предварительного засева в различные среды богатые органическими веществами, вторым этапом высевали инокулят на плотные агаровые среды с твинами-20, -40 и -60, являющиеся субстратами биохимических реакций, лежащих в основе определения липазы бактерий. Показано значительное снижение активности липазы с увеличением концентрации твинов. Авторы предполагают, что увеличение содержания твина в реакционной среде резко снижает эффективность процесса гидролиза.
По данным Akbulut N. et al. (1994) для выделения и дифференциации Y. enterocolitica агар МакКонки модифицированный с твином-80 оказштся эффективнее сред МакКонки: SS; висмут-сульфитной с бриллиантовым зеленым; желчной с фиолетовым красным и дезоксихолатной.
Аэробный питательный агар-среда для Bacteroides fragilis (Петраков А. А., 1982) содержит твин-80. Для упрощения процедуры выделения Вас. fragilis предлагается готовить среды на основе сухой среды для контроля стерильности производства ЦНИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва) с добавками гемина, витамина К, твина и др. (Петраков А. А., 1982; Баженов Л. Г., Исхакова X. И., 1985).
Большинство видов рода Serratia (энтеробактерии) способны гидролизовать твин-80, исключение составляет Sen odorifera.
Твин-80 входит в состав жидкой синтетической среды № 7 для выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала (Bernhardt С, Rentgen H.. 1975). Для их культивирования и фаго-типирования Garcia-Rodriguez J. et al. (1986) эффективно использовали среду RVB с твином-80. Между тем, еще в 1953 году Bloch и Noll показали слабовирулентность микобактерий туберкулеза, выращенных на среде с твином-80, и восстановление вирулентности при пересеве на среды без него (цит. по Кравченко М. А., 1984). В средах с твином-80 с потерей гидрофобности наблюдается диффуз-
ный рост микобактерий (Сидоров М. А. и соавт., 1995). Способность к гидролизу твина позволяет дифференцировать отдельные виды микобактерий (Lawrence, Kubica, 1986). Кроме того, твин-80 ингибирует рост микобактерий (Thomas С. et al., 1989). По данным Masaki S. et al. (1990, 1991) 0,05% (0,5 мг/мл) или более твина в жидкой среде оказывает бактериостатическое действие, приводит к удлинению клеток М. avium, уменьшает содержание в них гликоли-пидов, а также изменяет результаты биохимических тестов на ре-дуктазу нитратов, уреазу и арилсульфатазу. В то же время, твин-80 и аналогичные ему сурфактанты потенцируют действие антибиотиков на М. avium, что объясняется действием его непосредственно на клеточную стенку данного микроорганизма. Шим Н. В. и соавт. (1989) рассматривают твин-80 как агент, вызывающий L-трансфор-мацию микобактериальных клеток.
Признаком, дифференцирующим Erysipelothrix rhusiopathie (возбудителя рожи свиней и эризипелоида людей) от бактерий сходных родов, является неспособность к гидролизу твинов-20 и -80, тогда как листерии их гидролизуют, а у коринебактерий, лак-тобацилл и др. этот признак не определялся (Сидоров М. А. и соавт., 1995).
Твин-80 входит в состав сред Рогоза и МРС—для культивирования Lactobacillus; среды Бриге в модификации Шарп—для культивирования Pediococcus и среды для определения псевдока-талазы (ГОСТ 1044.11-89).
Из ряда сред использованных Lorenzini R., Bernardis F. (1987) для культивирования, идентификации и сохранения грибов Malassezia pachydermatis наиболее пригодным оказался сахарный агар, обогащенный 1,5% дрожжевого экстракта и 1% твина-80. Предложена среда для идентификации Candida albicans и Crypto-coccus neoformans, содержащая твин-80 и желчь (J. Clin. Microbiol., 1977, v. 5, p. 236—243). При сравнительном изучении 4 питательных сред Kurup V. et al. (1986) установили, что для получения бластоспор из мицеальной формы возбудителя североамериканского бластомикоза (Blastomyces dermatitidis) наиболее пригодна альбумино-казеиновая среда с твином, на которой обнаруживали характерные клетки с единичными почками. Waller J. et al. (1991) для поиска хламидоспор С. albicans производили посев на агаризованную среду с твином-80.
Волина Ё. Г. и соавт. (1982) изучали динамику формирования колоний лептоспир на средах, содержащих твин-80. Один из наиболее эффективных и экономически доступных источников жирных кислот, необходимых лептоспирам,—водорастворимые липиды. Из последних предпочтительны полисорбаты, к которым относятся твины 20—80—эфиры соответствующих жирных кислот. Содержание последних в них следующее (%):
твин-80: олеиновая кислота—64,45; линолевая—21,86; пальмитиновая—7,64; пальмитоолеиновая—1,89; стеариновая—1,44 и линоленовая—0,68;
твин-60: стеариновая кислота—64,26; пальмитиновая—33,96; гептодекановая—1,58; миристиновая—0,84 и арахиновая—0,14;
твин-40: пальмитиновая кислота—94,77; стеариновая—2,88; миристиновая—1,68; каприловая—0,125; лауриновая—0,126 и пентадекановая—0,229;
твин-20: лауриновая кислота—55,16; миристиновая—24,26; пальмитиновая—9,46; каприновая—4,65; каприловая—3,88 и стеариновая—1,23 (Ellinghausen, 1983).
Однако твины содержат определенное количество свободных жирных кислот (твин-80—до 3%), токсичных для лептоспир. Простейший способ их детоксикации—добавление к среде сыворотки крови или альбумина в обычных концентрациях или соединение твина с мелким порошком древесного угля, который хорошо адсорбирует все токсические примеси.
Оптимальная концентрация твина-60 в сложной среде составляет 200—300 мкг/л; для смеси твина-60 и твина-80 концентрация каждого компонента равняется соответственно 200 и 50 мкг/мл.
Для культивирования лептоспир предложены твин-альбуми-новые среды Ellinghausen, McCullogh в модификации Johnson, Harris (1967) и Russel E, Russel С. (1986), а также твин-альбумин-сывороточная среда Эллиса для выделения L. interrogans и усовершенствованная элективная среда для выделения лептоспир из контаминированного материала (Adler В. et al., 1986).
Белоусов В. И., Тюрина И. Н. (1996) показали возможность выращивания производственных штаммов лептоспир на твин-альбуминовой среде с использованием отечественных компонентов. Очищенный на ионообменной колонке отечественный твин-80 по качеству превосходил таковой фирмы «Merck». При промышленном культивировании оказался годным и неочищенный твин, но для его детоксикации на 0,25% в среду необходимо было добавлять не менее 0,2% альбумина.
Из жидких сред наиболее эффективной для накопления бак-териоцинов Bord. pertussis оказалась по данным Бакулиной Н. А. и соавт. (1980) среда типа Коэн-Уилера с добавлением 0,1% твина-80.
Kelly M. et al. (1988) провели комплексное двухэтапное исследование по оценке 4 сред для выделения шт. Aeromonas из фекалий, в том числе агара МакКонки, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1% твина-80.
Минеральные соли
Готтшалк Г. (1982) выделяет 10 химических элементов, требуемых для микроорганизмов в высоких концентрациях (С, О, Н, N, S, Р, К, Mg, Ca, Fe), минорные незаменимые элементы (Zn, Mn) и ряд элементов, необходимых только для отдельных
микроорганизмов с особым типом метаболизма (Se, Mo, Co, Cu,W).
Соли кальция и магния могут изменять чувствительность микроорганизмов к антибиотикам (Чайковская С. М. и соавт., 1981).
Подробный анализ лимитирования и ингибирования жизнедеятельности микроорганизмов ионами металлов (Fe, Ca, Mg, Мп) дали Мельникова В. А. и соавт. (1991).
Показана высокая чувствительность бактерий рода Pseu-domonas к солям Ва2+ (Сиволодский Е. П., 1988; Смирнов В. В., Киприанова Е. А., 1990). Угнетающее действие ионов бария ослабляется или устраняется ионами кальция и магния (но не марганца, кобальта, молибдена, меди и железа). Предполагается, что ионы бария являются антагонистами некоторых дивалентных катионов, играющих важную роль в стабилизации наружной мембраны.
Mustafa R, Whittenbury A. (1970) показали устойчивость ряда фитопатогенных псевдомонад, в отличие от флуоресцирующих сапрофитов, к солям марганца и чувствительность к солям кобальта.
В состав среды для Ps. aeruginosa, разработанной в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва), входят минеральные соли магния, калия (Мороз А. Ф. и соавт., 1976). Ионы К* облегчают образование у данных микроорганизмов пигментов (Якубчак О. Н., 1997). Для образования бактериальных белков необходимы анионы, содержащие серу. По этой причине в среды для Ps. aeruginosa вводят K2SO4 в диапазоне концентраций от 7 (селективная среда РЧЖ)—8 г/л (среда PFA— Gill У, Stock E, 1987)—до 10 г/л (среда Кинга A); MgSOo—в диапазоне от 0,2 (среда с ацетамидом) и 0,5 г/л (среда Паллерони-Дау-дарова) до 1,5 г/л (среды РЧЖ и Кинга В). В селективную среду для Ps. aeruginosa Федориной А. П. (1987) входит 0,22—0,66 мг/мл сульфата цинка. Ряд неорганических солей содержит среда культивирования Аджиевой А. А. и соавт. (1987). Содержание КгНРСЬ колеблятся в диапазоне от 0,3 (среда Хью-Лейфсона) до 1 (среда с ацетамидом) и 1,5 г/л (среда Кинга В).
По данным Tzouvelekis L. et al. (1990) недостаток Mg стимулировал продукцию белка HI всеми штаммами Ps. aeruginosa и снижал уровень синтеза ЛПС без изменения качественного состава последних. Выращенные на Mg-дефицитной среде Ps. aeruginosa проявляли повышенную чувствительность к сыворотке, расход Сз-компонента комплемента был снижен. Кроме указанного MgSOi, в среды в качестве соединения, содержащего ионы Mg2+, вводят MgCb в количестве 1,4 г/л (цетримидный агар, среда Кинга А) и 1,5 г/л (среда РЧЖ). По Blumentals J. et al. (1987) добавление в среду культивирования MgSO-t, ZnSO и CuSOi не влияло на синтез экзотоксина Ps. aeruginosa. Ионы Fe2+ тормозили, а ионы Са2+ усиливали синтез экзотоксина А, причем повышение кон-
центрации Са2+ с 25 до 500 мМ увеличивало выход экзотоксина как минимум в 3 раза. Добавление в среду СоСЬ снижало выход экзотоксина на 60%. В состав сред Хью-Лейфсона, МакКонки и среды с ацетамидом входит NaCl в количестве 5 г/л.
Кулаев И. С. и соавт. (1987) отмечают отрицательное влияние на синтез Ps. lytica фермента, обладающего бактериологической активностью в отношении ряда грамположительных микробов, некоторых солей в концентрациях, используемых обычно для приготовления питательных сред.
Вульфдитер Ш., Петер К. (1992) предлагают для получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы культивировать соответствующие микроорганизмы—продуценты из рода Pseudomonas (Ps. putida) на питательной среде, содержащей минеральные соли—сульфат магния, фосфаты натрия двузамещенного и калия однозамещенного, а также соединения железа и хлора.
Марцинкявичене Л. Ю. и соавт. (1991) отмечают повышение активности и чистоты холестеринэстеразы при культивировании его продуцента—Ps. mendocina ВКПМ В-2173 на среде, содержащей 0,5—2,5 г/л фосфата калия двузамещенного; 0,5—0,8 г/л се-миводного сульфата магния; 0,3—0,8 г/л хлорида калия и 1—3 г/л нитрата натрия.
По данным Бойкова Ю. Н. и соавт. (1991) выход и активность рестриктазы Psu 1 возрастают при культивировании Ps. stutzeri ВКПМ В-4724 в питательной среде, содержащей 1—2 г/л сульфата аммония; 0,5—0,7 г/л цитрата натрия и 0,001—0,002 г/л хлорида железа.
Иванов Ф. М. (1967) разработал полужидкую обогатительную среду, в состав которой входили 2 г/л фосфата натрия однозамещенного; 2 г/л цитрата натрия и 0,6 г/л гипосульфита.
Maudsley J., Kadis S. (1986) разработали синтетическую среду для культивирования гемолитически активных бактерий Н. pleu-ropneumoniae. Несмотря на снижение ростовых свойств, концентрация внеклеточного гемолизина на ней была в 8—10 раз выше, чем на среде с соевым гидролизатом и 0,6% дрожжевого экстракта, а также бульоне на сердечной вытяжке (контрольные среды). Продуцируемый гемолизин является термолабильным белком, активность которого зависит от концентрации в среде ионов железа в определенных фазах роста бактериальных культур.
Vanden В. (1987) на основании значительного улучшения ростовых свойств среды для 19 испытанных штаммов Н. ducreyi при добавлении 0,01 мкг/мл селенита натрия сделал предположение о влиянии на высеваемость этого микроорганизма неодинакового количества селена в образцах крови, сыворотки и воды, используемых для приготовления сред.
Wooten J. et al. (1987) показали использование в качестве источников железа бактериями Н. influenzae гема, гемоглобина, миоглобина, гемоглобин-гаптоглобина и насыщенного на 30% человеческого трансферрина, но не лактоферрина.
Pidcock K. et al. (1988) на определенной среде с ограниченным содержанием железа изучали влияние гемина и других (не из крови) источников железа на рост Н. influenzae типа b и нети-пируемых штаммов. Использовали железо из гемина, гемоглобина, гемоглобин-гаптоглобина, гемин-гемопексина. Рост усиливался частично очищенным человеческим трансферрином, но не лактоферрином или ферритином. Очищенный ферриентерохо-лин и ферридесферриоксамин не влияли на рост этого микроба. По данным Gorringe A. et al. (1991) при дефиците железа в ростовой среде у Bord. pertussis и Bord. parapertussis появляются новые мембранные белки и сидерофоры, обеспечивающие перенос ионов железа с трансферрина бактериальной клетке.
В низких концентрациях бикарбонат натрия стимулировал, а более высоких—ингибировал размножение мелких спирохет (Fiehn N.-E., 1989).
Малахов Ю. А. (1992) рассматривает потребность лептоспир в минеральных солях—источниках Mg, Ca, Mn, Fe, Zn, К.
В качестве селективной при исследовании загрязненных проб используется среда с мочевиной и солями кобальта (Росто-мянС. В., 1973).
Для дифференциации лептоспир наибольшее применение нашел бикарбонатный тест: патогенные лептоспиры, в отличие от сапрофитных, не растут на средах с NaHCO. Используются также тесты со средами содержащими соли меди, сулемы, лития, нитрата кобальта и серебра (Троп И. Е., Бутакова А. Е., 1976). Daok G. et al. (1961) изучали питательную потребность Т. pallidum в дивалентных ионах.
Pekala D., Padgett P. (1986) исследовали рост и микроаэро-фильную природу видов Borrelia при культивировании в среде А с добавлением соединений, детоксицирующих супероксидные и гидроксильные радикалы, перекись водорода, атомарный кислород. Из испытанных диметилсульфоксида, формата натрия, ман-нита, дитиотреитола и активированного угля, первые два оказались наиболее эффективными стимуляторами роста боррелий. Хороший результат получен также при комбинации хлорида железа и метабисульфита калия в концентрации 0,002%.
По данным Sarafian S., Morse S. (1986) продукция токсина-1 синдрома токсического шока шт. St. aureus 1169 в синтетической безуглеводной среде возрастает при увеличении концентрации ионов Mg2+ до 2,0 мМ, а при дальнейшем увеличении концентрации—снижается. В анаэробных условиях концентрация ионов Mg2+ не влияла на синтез токсина. Между тем, отмечается независимость процессов синтеза токсина и роста микроорганизмов друг от друга.
Несколько иные результаты получены Taylor D., Holland К. (1988), наблюдавших в условиях дефицита ионов Mg2+ (100 мкМ) заметное снижение скорости роста популяции St. aureus и продукции токсина по сравнению с культурой, выращиваемой при
избытке ионов Mg2+ (1 мМ). Использовалась синтетическая среда, в состав которой входило 6 аминокислот, глюкоза, 2 витамина и соли.
James J. et al. (1989) также изучали влияние магния на продукцию in vitro токсина-1 St. aureus. Предварительно выращенные на триптиказо-соевом агаре колонии St. aureus суспендировали в среде без Mg2+ и после отмывания инкубировали в синтетической среде с Mg2+ в концентрации от 4,6 мМ до 0,033 мкМ при ограниченном содержании либо валина, либо триптофана, в аэробных и анаэробных условиях. Mg2+ влиял на размножение St. aureus и продукцию ими токсина-1. Специфическая активность токсина-1 увеличивалась с ростом концентрации Mg2+ и была максимальной при физиологических уровнях Mg2+. При анаэробных условиях St. aureus росли, но не продуцировали токсин-1. В ферментере при содержании валина в среде не более 10 мкг/мл его продукция и специфическая активность повышались с уменьшением концентрации триптофана, независимо от концентрации Mg2+ в среде. Таким образом, не удалось подтвердить предположение о специфическом контролирующем действии Mg на продукцию токсина-1 St. aureus in vitro.
Bhat К. et al. (1994) установили необходимость для начала роста St. aureus не менее 0,01 мМ Mg2+ в среде и усиление роста при увеличении его концентрации до 1,6 мМ. Причем от содержания этого иона в среде зависят утилизация глюкозы, кислотный синтез, и он мог снижать ингибиторный эффект избыточного содержания Со и Zn на рост St. aureus.
Yabu К. (1986) разработал эффективный метод получения L-форм St. aureus при 30°С в инкубационной жидкой среде, содержащей осмотические протекторы (сульфат магния, хлорид натрия) в сочетании с L-трансформирующими агентами.
Для развития самых различных видов бактерий в деминерализованной синтетической среде требуется от 0,3 до 4 мМ железа (Dhople A. et al., 1996). Одним из его источников в среде культивирования является сыворотка крови.
Известна непосредственная связь патогенности микроорганизмов с их способностью усваивать железо из организма хозяина, основными источниками которого являются белки лакто-феррин и трансферрин. Большинство бактерий для утилизации железа синтезируют специальные, обладающие высоким сродством к нему, низкомолекулярные соединения—сидерофоры. Виды патогенных бактерий способные утилизировать железо непосредственно из лактоферрина и трансферрина без предварительного синтеза сидерофоров единичны—это N. gonorrhoeae, N. meningitidis и Н. influenzae. Кроме того, в качестве не-сидерофоробразующих отмечаются М. pneumoniae, Trichomonas vaginalis и Bacteroides fragilis. Перечисленные нейссерии могут использовать в качестве источника железа только определенный тип трансферрина, а именно человеческий. Механизм усвоения
железа несидерофоробразующими бактериями мало изучен. Предполагается, что для нейссерий основной стадией утилизации железа является биосинтез специфических железорегулиру-ющих белков-рецепторов, интенсивно синтезируемых в условиях дефицита железа в среде культивирования (Филатова Т. Н. и соавт., 1995).
В плотных средах для L. pneumophila оптимальное содержание пирофосфата железа равно 0,25 г/л, тогда как в жидких его концентрация может быть уменьшена (Ristoph J. et al., 1981; Warren W, Muller R., 1981) или же этот компонент вообще может отсутствовать (Костюченко В. И. и соавт., 1985). Соли NaCl, MgSO, Ca(NCb)2, (NH4)2S04, Fe4(P207)3 в концентрациях 10-50 мг/л незначительно стимулируют рост L. pneumophila и продукцию им термолабильного токсина, тогда как NaHCCh в количестве до 100 мг/л не влиял, a ZnS04 и МпСЬ уже в концентрациях 20 и 100 мг/л, соответственно, подавляли оба процесса (Белый Ю. Ф. и соавт., 1986).
Рублевым Б. Д. и соавт. (1988) показана возможность ограничения роста бактерий чумы уровнем содержания железа в питательной среде. Вирулентные штаммы обладали более выраженным механизмом ассимиляции его по сравнению с вакцинным. Ионы железа извлекаются при контакте поверхности клеток с железонасыщенным трансферрином.
Esteve С, Amaro С. (1991) изучали образование сидерофоров у Aeromonas spp. выделенных от европейского угря. Условия с ограниченным содержанием железа получали добавлением хелатных соединений, содержащих железо (ЭДДА). Минимальные ингиби-торные концентрации (MlС) ЭДТА и образование сидерофоров были продемонстрированы на хром-азурол-S (CAS)-arape. Все исследованные штаммы были способны расти при низком содержании железа. Хелатные типы сидерофоров производили все виды и были функционально связаны с энтеробактином.
Simpson L. (1987) изучала способность V. vulnificus компенсировать недостаток железа использованием связывающих этот элемент белков. Изученные штаммы не были способны извлекать железо из недостаточно насыщенных им лактоферрина или ферритина, при полном же насыщении железом этих белков рост бактерий усиливался. Ни один штамм не усваивал железо из 30% насыщенного трансферрина, но они различались по способности усваивать его из полностью насыщенных форм. Вирулентный штамм, в отличие от авирулентного, более эффективно использовал трансферрин при условии полного насыщения его железом.
Минимальное количество железа, необходимое для полного роста микобактерий, колеблется в пределах 1—4 мМ. Dhople A. et al. (1996) связывают интенсивность роста М. avium с уровнем насыщения трансферрина железом: высокое содержание железа стимулирует рост данного микроорганизма.
Предполагается регулирующая роль кальция в разнообразных внутриклеточных процессах у прокариот, в том числе в развитии, дифференциации и споруляции у актиномицетов (Иванова И. В. и соавт., 1994; Daza A. et al., 1989; Natsume M., 1989). Инициирование спорообразования объясняют нарушением кальцием внутриклеточного фосфатного равновесия в сторону снижения по причине образования нерастворимых фосфатов кальция. Эффективность влияния кальция зависит от концентрации его свободных ионов, вследствие чего в связанном виде, например в форме карбоната, он практически не воздействует на дифференциацию актиномицетов (Иванова И. В. и соавт., 1994). Биологическое действие кальция основано на его структурных свойствах, благодаря которым он способен связываться с большими полимерными молекулами, а также образовывать комплексы с низкомолекулярными анионами и нейтральными лиганда-ми (Kazmierczak J., 1986).
По данным Волковой В. П. и соавт. (1985) из минеральных солей наиболее способствуют споруляции В. anthracis соединения магния и марганца, причем последний обладает подобным эффектом и относительно многих других видов бациилл (Hodges N., Brown R., 1974; Oh Young, Freese E., 1976; Перт, 1978; Смирнов В. В. и соавт., 1982).
Edwards R. et al. (1997) показали влияние ионов цинка на активность металло-р-лактамаз у Bact. fragilis. Наибольшая активность фермента отмечалась при концентрации сульфата цинка 50—500 мкМ. Добавление Zn в среду увеличивает образование CdS-частиц, определяющих токсичность К1. pneumoniae (Holmes J. et al., 1997).
Отмечается увеличение токсичности ионов Zn хлоридом натрия, Sn—агар-агаром и уменьшение токсичности Cd хлоридом натрия, Sn, Cd, Pb, Ni и Zn—силикагелем, Cd и РЬ—фосфатами, Pb—карбонатами. Ингибиторными свойствами обладает комплекс меди с пептоном (Bridson E., Brecker А., 1970). Кожо-карь Э. И. и соавт. (1991) предлагают в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры при выращивании грибов использовать 0,55—0,76 г/л хлорида кадмия.
По Zaika L. et al. (1997) добавление поливалентных ионов металлов в среду культивирования L. monocytogenes, например среду BHI,содержащую полифосфат натрия предотвращало инги-бирующее действие последнего на данный микроорганизм.