Сочетанное действие полиморфных форм ГСТ
Проведённые в 90-х годах исследования как онкологических, так и ряда других заболеваний, показали, что комбинации генотипов часто обусловливают более высокий риск, чем индивидуальный ген, т. е. имеются межгенные взаимодействия. [таблица 1]
В ходе исследований обнаружена более высокая частота вариантных генов глутатион-S-трансфераз ГСТM1 и ГСТП1 у больных раком желудка, чем у здоровых лиц, что может свидетельствовать о более высоком риске заболевания РЖ для носителей данных генотипов, что может обусловить неодинаковую степень предрасположенности к онкологическим заболеваниям в условиях влияния токсических факторов. [12]
В качестве примера может быть использована корреляция числа нулевых аллелей гена ГСTM1 с выраженностью количественных показателей атопии у больных БА, а в работе увеличение показателей ассоциации генов ГСTM1 и ГСTT1 с атопической БА с увеличением числа нулевых аллелей этих генов. Эти данные указывают на влияние ферментов биотрансформации на функционирование иммунной системы. Каким образом реализуется это влияние, пока неизвестно.
Исследования показали, что полиморфизм генов, связанных с поддержанием уровня иммуноглобулина Е, имеет бoльшее значение для формирования клинических проявлений БА, чем в предрасположенности к ней.
Установлено наличие следующих генных взаимодействий:
· аддитивный эффект в усилении риска бронхиальной астмы и атопического дерматита для сочетания гомозиготных делеций генов ГСТM1 и ГСTT1;
· синергический эффект сочетания гомозиготной делеции гена ГСTT1 и гомозиготы по аллелю дикого типа ГСТП1;
· аддитивный защитный эффект для геторозиготных генотипов по локусам С481Т и G590A гена НAT2. [14]
Ингибиторы активности глутатион-S-трансфераз рассматриваются как наиболее перспективные модификаторы лекарственной устойчивости. В связи с этим этакриновая кислота (обычно применявшаяся как диуретик) проходит клинические испытания в качестве препарата, преодолевающего лекарственную устойчивость, связанную с ГСХ. Бутионинсульфоксамин снижает внутриклеточный уровень глутатиона и преодолевает устойчивость клеток к алкилирующим соединениям. Бутионинсульфоксамин применяют в экспериментах в качестве препарата, влияющего на МЛУ. С ГСХ связывают результаты лечения лимфом . Повышение активности ГСТ наблюдается в устойчивых к хлорбутину случаях хронического лимфолейкоза. Экспрессию этих ферментов рассматривали как прогностический признак при ранних формах рака молочной железы.[20]
Материалы и методы
Объект исследования
Объектом исследования являются образцы ДНК, фиксированный на Whataman FTA Classic Card. Всего было отобрано проб. Для сбора и хранения биологического материала использовалась бумага, на которую раскапывалась цельная кровь, а затем высушивалась. Каждый образец хранится под уникальным идентификационным номером.
Генетический материал, экстрагированный из образцов, был подвергнут аллелеспецифическому пцр с последующей детекцией продуктов реакции.
Было исследовано влияние полиморфизма генов семейства ГСТ на риск заболеваемости различными видами рака с расчетом относительного риска (RR) по следующим параметрам: ***
2.2. Экстрагирование ДНК из соскоба с внутренней стороны щеки/цельной крови, фиксированных на Whatman FTA Classic Card [http://www.whatman.com/FTANucleicAcidCollectionStorageandPurification.aspx]
Данный метод фиксации образцов позволяет многократно использовать один и тот же генетический материал для нескольких пцр-реакций и позволяет хранить образцы при комнатной температуре *
Забор образцов
Взятие соскоба с внутренней стороны щеки производится при помощи набора, содержащего индивидуальный аппликатор, упакованный в пластик (9х15 см), и помещенный в опломбированный пакет.
Образец высушивают, пакеты сново пломбируют. Готовый образец можно хранить при комнатной температуре.
Приготовление образцов
Из каждого фиксированного образца вырезают круглый участок диаметром 3 мм.
Вырезанный участок трижды покрывают метанолсодержащим составом, затем высушивая на воздухе в первый раз при комнатной температуре в течение 20 минут, затем дважды – при температуре 37 °С в течение 40 минут. Метанол стимулирует преципитацию гема к бумаге.
С помощью щипцов высохшие образцы переносят в тонкостенные (0,2 мл) пцр-пробирки и приливают 5 µл буфера и 45 µл дист. воды. Образцы инкубируют последовательно при 60 °С в течение 30 минут; 99,9°С в течение 10 минут; 4 °С до остывания.
Перед началом инкубации добавляют протеинкиназу К (50 µг/мл), которая инактивируется при температуре 99,9 °С. Это позволяет улучшит сохранность генетического материала.