Анализ дифференцировки мезенхимных стволовых клеток in vitro
Принцип анализа:
Стволовые клетки функционально определяются своей способностью к самовоспроизведению и генерации большого числа дифференцированных прогениторных клеток, которые в дальнейшем развиваются в специализированные клетки организма. Различные популяции стволовых клеток были выделены из разных тканей взрослого организма, например мезенхимные стволовые клетки (МСК) были выделены из костного мозга. МСК имеют способность дифференцироваться в адипоциты (клетки жировой ткани), хондроциты (клетки хрящевой ткани), остеоциты (клетки костной ткани), гепатоциты ( клетки паренхимы печени), кардиомиоциты (мышечные клетки сердца) и нейроны. Стволовые клетки способны к дифференциации при получении сигнала “извне”. Эти сигналы в любом организме возникают естественным путем, но могут быть созданы искусственно в лабораторных условиях. Известно, что специфическая дифференцировка стволовых клеток может быть индуцирована микроокружением специальных культуральных сред.
В процессе выделения и культивирования МСК их статус лучше всего устанавливается по их способности к дифференцировке в разные мезенхимные клеточные линии, – именно эта способность и определяется с помощью анализа дифференцировки. R&D Systems' Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit (специальная тест система, созданная для проведения данного анализа in vitro) содержит специальные добавки в питательную среду, которые позволяют индуцировать дифференцировку МСК в адипо-, остео- и хондроциты, а также набор антител для определения фенотипов зрелых клеток.
Материалы, входящие в набор для анализа:
- адипогенная добавка в питательную среду
- остеогенная добавка в питательную среду
- хондрогенная добавка в питательную среду
- ITS добавка, содержащая инсулин, трансферрин, альбумин и линолевую кислоту
- лиофилизированные козлиные поликлональные антитела к белку FABP4 (белок-переносчик жирных кислот, специфичен для адипоцитов)
- лиофилизированные мышиные поликлональные антитела к остеокальцину (маркер формирования кости)
- лиофилизированные козлиные поликлональные антитела к аггрекану (протеогликан клеток хрящевой ткани)
Материалы:
-мезенхимные стволовые клетки человека
-24-луночные культуральные планшеты
- круглые покровные стекла (12 мм)
- 15 мл пробирки для центрифугирования
- микропипетки переменного объема
-хирургические щипцы
Реагенты:
-питательная среда αMEM
- питательная среда D-MEM/F-12
- сыворотка плодов коров
- фосфатно-буферный раствор (ФБР)
- пенициллин
- стрептомицин
- глутамин
- 4% раствор параформальдегида в ФБР
- 1% раствор альбумина в ФБР
- раствор, содержащий 0,3 % TritonX-100, 1% альбумина, 10% сыворотки в ФБР
- гистологическая среда
-вторичное антитело, конъюгированное с флюорофором
-дистиллированная вода
Оборудование:
- термостат ( 37 ° C, 5% CO2)
- центрифуга
-флуоресцентный микроскоп
- водяная баня
- криостат
Схема анализа:
Состав питательных сред.
| ОСНОВНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА | СПЕЦИАЛЬНАЯ ДОБАВКА | |
| Адипоциты | αMEM 90% Сыворотка плодов коровы 10% Пеннициллин + Стрептомицин + Глутамин | гидрокортизон изобутилметилксантин индометацин |
| Остеоциты | αMEM 90% Сыворотка плодов коровы 10% Пеннициллин + Стрептомицин + Глутамин | дексаметазон аскорбат-фосфат бета-глицеролфосфат |
| Хондроциты | D-MEM/F-12 99% ITS добавка 1 % Пеннициллин + Стрептомицин + Глутамин | дексаметазон аскорбат-фосфат пролин пируват |