Характеристика ДНК-полимераз прокариот и эукариот
ДНК-полимеразы присутствуют во всех прокариотических и эукариотических клетках. Все известные до сих пор прокар. и эукар. ДНК-полимеразы обладают единым свойством – они способны синтезировать ДНК посредством присоединения каждого последующего дезоксинуклеозидтрифосфата только к 3’-ОН концу уже имеющейся цепи, называемой праймером. Т.е. все цепи синтезируются в направлении 5’→3’ (5’→3’-полимеразная активность), и наращивание полинуклеотидов в обратном направлении не происходит никогда. А также ДНК-полимеразы могут только удлинять уже существующие цепи, причем только в присутствие цепи, играющей роль матрицы.
Репликация ДНК- процесс точного копирования молекулы ДНК в рез. которого образ-ся 2 одинак. двуспиральные молекулы.
- синтез новой ДНК начинается на затравке (праймере) – фрагмент РНК (сначала РНК-полимераза синтезирует РНК (не нужна затравка), используя в качестве матрицы родительскую двухцепочечн. ДНК).
- фрагмент РНК (ОН-группа) служит для присоед-я первого нуклеотида ДНК (в лидирующей цепи). В случае отстоющей цепи: ДНК-полимераза III синтезирует фрагмент Оказаки, затем еще и еще, на некотором расстоянии др. от др. Для этого полимеразе необх. новый праймер с открытым 3’-ОН-концом (праймаза синтезирует короткие РНК-праймеры на определенном расстоянии др. от др. Затем они дополняются ДНК-полимеразой III).
- Затем ДНК-полимераза I удаляет РНК-праймер путем отщепления с его 5’-конца рибонуклеотидов (5’→3’-экзонуклеазная активность) и одновременно замещения их дезоксирибонуклеотидами.
- Фрагменты Оказаки сшиваются ДНК-лигазами (ферменты, которые катализируют образ-е ков. связи между 5’-фосфатной- и 3’-ОН-гр. соседних фрагментов цепи ДНК в составе двойной спирали).
ДНК-полимеразы I и III могут удалять последний ошибочно включенный нуклеотид с 3’-конца посредством гидролиза фосфодиэфирной связи (3’→5’-экзонуклеазная активность).
Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I кишечной палочки – одиночный полипептид. Обладает полимеразной активностью (см. выше) и экзонуклеазной (3’→5’ экзонукл. акт-ть : осущ-т гидролиз фосфодиэфирных связей в оной из цепей ДНК, начиная с 3’-конца цепи, при ошибочном спаривании и 5’→3’ экзонуклеазная активность : гидролиз идет с противоположного конца, при удалении РНК-праймера). Различные активности ДНК-полимеразы I принадлежат разным участкам полипептидной цепи с молекулярной массой 109.000 дальтон. Так. обр., ДНК-полимераза I способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва и одновременно удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва. Этот процесс, называемый пик-трансляцией, играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК.
ДНК-полимераза IIприсоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем ДНК-полимераза I, и не обладает 5'-»3' экзонуклеазной активностью. Следовательно, ДНК-полимераза II может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять пик-трансляцию. Роль ДНК-полимеразы II в репликации и сохранении хромосомной ДНК Е. coli до настоящего момента неясна.
ДНК-полимераза Ш-холофермент ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК Е. coli. В каждой клетке содержится всего 10-20 молекул ДНК-полимеразы III, но, тем не менее она является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в синтезе лидирующей цепи и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки.
Активности, которые проявляют ДНК-полимераза I и ДНК-полимераза III сходны, однако последняя обладает повышенным сродством к матрице и характеризуется более высокой эффективностью копирования. В результате выделения и очистки ДНК-полимеразы III, как правило, получают несколько различных форм, и до сих пор остается неизвестным, какая из них представляет собственно фермент, включающийся в процесс репликации in vivo. По последним данным представляется вероятным, что ДНК-полимераза Ш-холофермент существует в двух формах, каждая из которых отличается определенным набором вспомогательных субъединиц, придающих ферменту специфические свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой - прерывистой отстающей.
В эукариотических клетках идентифицировано множество ДНК-полимеразных активностей, однако физические и функциональные свойства отдельных ферментов изучены менее детально, чем у соответствующих ДНК-полимераз прокариот. В соответствии с пересмотренной номенклатурой все эукариотические ДНК-полимеразы в настоящее время классифицируются следующим образом: ДНК-полимераза α, ДНК-полимераза β, ДНК-полимеразаγ, ДНК-полимераза δ и ДНК-полимераза δ.
ДНК-полимераза α,являясь ядерным ферментом, представляет собой единственную полимеразу, уровень которой существенно возрастает в момент репликации хромосомной ДНК. Ее полимеразная активность связана с большим полипептидом, но она существует и, возможно, функционирует как мультисубъединичный белок, аналогично ДНК-полимеразе-холоферменту Е. coli.Основн. биол. ф-ции:инициацияи синтез ведущей цепи, частая инициация отстающей цепи. ДНК-полимераза α играет главенствующую роль в процессе репликации ядерной ДНК. Сначала комплекс ДНК-полимеразы α с праймазой инициирует синтез лидирующей цепи, а затем инициируется синтез фрагментов Оказаки.
Ядерная ДНК-полимераза β - это одиночный полипептид, функция которого состоит в заполнении пробелов при репарации повреждений ДНК, а также в эксцизионной репарации поврежденных оснований.
Роль ДНК-полимеразы γ, состоящей из четырех идентичных полипептидов, сводится к осуществлению репликации митохондриального генома. Ее роль в ядре не известна.
Описанная не так давно ДНК-полимераза δ, как полагают, принимает участие в репликации лидирующей цепи ДНК. Впервые этот фермент был охарактеризован как эукариотическая ДНК-полимераза, обладающая 3'-»5'-экзонуклеазной активностью. Впоследствие все эукариотические ДНК-полимеразы, содержащие 3 '->5 '-экзонуклеазную субъединицу, было принято считать ДНК-полимеразой δ. Было также показано, что ДНК-полимераза δ способна проявлять свою активность только в присутствие вспомогательного белка, известного как ядерный антиген пролиферации клеток (PCNA).
Позже из тимуса теленка и дрожжей удалось выделить независимую от PCNA ДНК-полимеразу, также обладающую 3’→5’-экзонуклеазной активностью. Это фермент ДНК-полимераза ε.Существует предположение, что ДНК-полимеразаεявляется второй ДНК-полимеразой, синтезирующей отстающие цепи ДНК, участвует в процессе заполнения брешей м-ду фрагментами Оказаки и удаляет РНК праймеры на концах фрагм. Оказаки.