Определение диастазного числа
Метод основан на колориметрическом определении количества субстрата, расщепленного в условиях проведения ферментативной реакции, и последующем вычислении диастазного числа.
Диастазное число характеризует активность амилолитнических ферментов меда.
Диастазное число выражают количеством кубических сантиметров раствора крахмала массовой долей 1 %, которое разлагается за 1 ч амилолитическими ферментами, содержащимися в 1 г безводного вещества меда.
1 см3 раствора крахмала соответствует 1 единице активности.
Подготовка к испытанию
Приготовление ацетатного буферного раствор. Ацетатный буферный раствор концентрации 0,2 моль/дм3 с рН 5,0 готовят, смешивая одну объемную часть раствора уксусной кислоты и три объемные части раствора уксуснокислого натрия. В полученном буферном растворе растворяют 2,4-динитрофенол с таким расчетом, чтобы его концентрация в комбинированном реактиве составила 0,05%. Проверяют рН раствора потенциометрически и в случае отклонений от рН 5,0 показатель корректируют, добавляя раствор уксусной кислоты концентрации 0,2 моль/дм3 или раствор уксуснокислого натрия концентрации с (СН3 СООNа) = 0,2 моль/дм3.
Приготовление комбинированного реактива. Комбинированный реактив готовят из восьми объемных частей раствора крахмала, пяти объемных частей буферного раствора с 2,4-динитрофенолом и одной объемной части раствора хлористого натрия.
При приготовлении комбинированного реактива в количестве, равном или большем 1дм3, объем соответствующих растворов отмеривают с погрешностью не более 0,5 см3.
Полученную смесь тщательно встряхивают.
Комбинированный реактив хранят при комнатной температуре не более 3мес.
Приготовление раствора меда.5г меда, взвешенного с погрешностью не более 0,01г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 50 см3. 1 см3 такого раствора содержит 0,1г меда.
Приготовление раствора крахмала.0,25г крахмала, взвешенного с погрешностью не более 0,001 г, размешивают в стаканчике вместимостью 50см3 с 10-20см2 дистиллированной воды и количественно переносят в коническую колбу, где не сильно кипит 80-90см3 дистиллированной воды.Кипение продолжается 2-3мин. Колбу охлаждают до 20 ºС, содержимое количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки
.Проведение испытания В сухую пробирку отмеряют из бюретки 14,0см3 комбинированного реактива. Пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают на 10 мин в водяную баню при температуре 40 ºС. Затем в пробирку вносят пипеткой 1,0 см3 раствора меда. Содержимое перемешивают пятикратным перевертыванием, и пробирку вновь помещают на водяную баню, одновременно включая секундомер. Пробирку выдерживают на водяной бане в течение 15 мин при температуре (40±0,2) ºC.
Пипеткой отбирают 2,0см3 реакционной смеси, вносят ее при перемешивании в мерную колбу вместимостью 50см3, содержащую 40см3 воды и 1см3 раствора йода, температурой 20ºС. Раствор доводят водой до метки. Колбу закрывают пробкой, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают на водяной бане при 20 ºС в течение 10мин.
Одновременно проводят контрольный опыт, заменяя раствор меда дистиллированной водой.
Оптическую плотность измеряют на фотоэлектроколориметре против воды при светофильтре длиной волны 582 или 59 нм, используя кювету рабочей длиной 1,0см. Колориметрируя растворы, определяют значения оптической плотности испытуемого раствора Дисп и контрольного опыта Дк с точностью отсчета 0,001.
Диастазное число меда Х4 в пересчете на 1 г безводного вещества вычисляют по формуле
(5)
где .Dk – оптическая плотность раствора, определенная контрольным опытом;
Dисп – оптическая плотность испытуемого раствора;
80 – коэффициент пересчета;
W – массовая доля воды в меде, %.
За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать 0,5ед. Готе в интервале от 0 до 10ед.