Выявление ускоряющего и замедляющего влияния на ферменты
Хлорид натрия - активатор амилазы слюны, ингибиторы амилазы ионы серебра, соли меди, свинца.
Ход работы. В три пробирки внести по 3 мл слюны, разведенной 1:3 водой. В первую пробирку добавить 2 капли 1%-ного раствора хлорида натрия, во вторую - 1 каплю 1%-ного раствора сернокислой меди, в третью - каплю воды (контроль). Затем во все пробирки внести по 5 капель 1%-го раствора крахмала и оставить при 370С на 3 мин, после чего внести во все пробирки по одной капле раствора Люголя и сравнить интенсивность появляющегося синего окрашивания, характерного для крахмала. Выявить (по интенсивности окраски), в какой из пробирок произошел наиболее полный распад крахмала. Напомним, что интенсивность окраски пропорциональна концентрации крахмала.
2. Количественное определение активности амилазы мочи (диастазы).Нормальная активность диастазы в моче здоровых людей невелика - от 4 до 64 ед. (за единицу принимают то её количество, которое за 30 мин при 380С полностью расщепляет 1 мл 0,1%-ного раствора крахмала).
При некротических процессах или воспалительных заболеваниях поджелудочной железы, при воспалении околоушной железы увеличивается активность диастазы в крови, и, как следствие, в моче. Это наблюдение является вспомогательным диагностическим признаком.
Ход работы. В десять пронумерованных пробирок внести по 1 мл 0,14 н раствора хлорида натрия. В одну из пробирок внести 1 мл исследуемой мочи, смешать и затем перенести 1 мл смеси во вторую пробирку, смешать, перенести в третью и т. д. Из последней (десятой) пробирки 1 мл смеси вылить. Во все пробирки внести по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала и по 1 мл 0,14 н раствора хлорида натрия, смешать, поместить на водяную баню (450С) на 15 мин.
Одновременно и быстро охладить все пробирки, поместив их в холодную воду и добавить в каждую по одной капле раствора Люголя. Жидкость окрашивается в желтоватый цвет йодом, в различные оттенки розового (декстрины) и фиолетового (декстрины с большим размером молекул), а также в синий цвет (крахмал).
Учет результата. Рассчитать количество мочи в последней (слева направо) пробирке, сохранившей желтоватую окраску (полное расщепление крахмала).
Допустим, это пробирка № 4, моча в которой разведена в 16 раз по сравнению с пробиркой 1, где было 0,5 мл мочи. Следовательно, в пробирке 4-й мочи содержится 0,03125 мл (0,5/16). Это количество мочи вызвало расщепление 2 мл 0,1%-го раствора крахмала, а 1 мл мочи способен расщепить х мл, т.е. 0,03125 мл мочи расщепило 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала, а 1,0 мочи может расщепить х мл крахмала.
Составляем уравнение и рассчитаем значение величины Х:
Х = 
= 64 мл 0,1 %-ного раствора крахмала,
следовательно, в моче содержится 64 ед. амилазы на 1 мл мочи
3адание: каждый студент получает результаты анализа двух проб мочи и определяет содержание диастазы в одном мл мочи, выражая в единицах. Результат сопоставить с нормальными значениями.
Выполнить следующее:
1. При определении активности фермента получены данные, представленные в таблице:
| рН | 1,0 | 1,2 | 1,5 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 7,0 | 8,0 |
| Активность, ед. | 2,0 |
Построить график зависимости активности энзима от рН, высказать предположение о том, какой фермент находится в растворе, определить принадлежность фермента к классу и группе соответственно высказанному предположению.
2. Оптимум рН исследуемого фермента 6,9 - 7,0, субстрат фермента - высокомолекулярный природный полимер, обнаруживаемый по характерному окрашиванию в присутствии йода; продукты взаимодействия фермента с субстратом окрашиваются при нагревании в присутствии сернокислой меди в красно-кирпичный цвет.
Назовите фермент, субстрат, реагент, используемый для обнаружения субстрата, продукты гидролиза субстрата и определите принадлежность фермента к классу, группе.
3. Субстрат исследуемого фермента образует белый осадок при нагревании, дает положительную биуретовую реакцию. После длительной инкубации с ферментом при разных значениях рН интенсивность биуретовой реакции снизилась, увеличилось число свободных аминогрупп, усилилась положительная реакция с нингидрином. Особенно заметными эти изменения были при рН 8,0 - 9,0.
Назовите субстрат, фермент, определите принадлежность фермента к классу и группе. Почему увеличилось число свободных аминогрупп и нингидриновая реакция: стала интенсивнее?
4. За единицу активности амилазы слюны принимают то ее количество, которое расщепляет за 30 мин при 380С 1 мл 0,1%-ного раствора крахмала. При инкубации разведенной слюны обнаружилось, что в восьмой пробирке реактив Люголя окрашивает жидкость в желтый цвет, а в девятой появился розовый оттенок. Разведение слюны готовили в геометрической прогрессии со знаменателем, равным двум (в пробирке 1 был 1 мл слюны). Количество раствора крахмала везде было одинаковым - 1 мл. Сколько единиц активности амилазы содержит 1 мл исследуемой слюны?
5. Исследуемый фермент расщепляет внутримолекулярные связи (исключая связи С-С) согласно реакции А + Б +Н2О> АН+БОН.
К какому классу относится фермент?
6. Фермент расщепляет С - С связи негидролитическим путем. Назовите класс, к которому относится фермент.
8. К какому классу относится фермент, катализирующий превращение молекулы глюкозы в молекулу фруктозы?
9. Назовите класс, к которому относится фермент, катализирующий реакции типа СН3 - СО - СООН + CО2 → HООC - СН2 – СО - СООН.
ЗАНЯТИЕ 7 (Введение в обмен веществ и энергии.
Биологическое окисление).
Цель: 1. Познакомиться с определением понятия «Обмен веществ», убедиться в том, что обмен веществ – совокупность всех химических превращений в организме; познакомиться с терминологией, используемой при изучении настоящего раздела, уяснить суть понятий «анаболизм» и «катаболизм» и их отличия от терминов синтез и распад. 2. Познакомиться с историей развития представлений о биологическом окислении и современным понятием «биологическое окисление», с представлением о формах биологического окисления, роли свободных радикалов кислорода, значении свободнорадикального окисления.
Студент должен знать:
1. Что включает понятие «Обмен веществ».
2. Как сочетаются в обменных процессах (анаболических и катаболических) реакции синтеза и распада.
3. Что значит «метаболический путь», виды метаболических путей.
4. Чем отличается биологическое окисление от окисления в неживой природе.
5. В чем заключается биологический смысл окисления в организмах.
6. Структуру макроэргических соединений.
7. Что представляет собой свободнорадикальное окисление.
.Студент должен уметь:
1. Отличать понятия катаболизм и анаболизмот понятий синтез и деструкция (расщепление).
2. Охарактеризовать основные этапы метаболизма
3. Составить схему круговорота энергии и веществ в живой природе с учетом аутотрофных и гетеротрофных организмов.
4. Изобразить структурные формулы важнейших макроэргических соединений живой природы.
5. Составить схему экспериментального выявления окислительно-восстановительных свойств у исследуемого вещества (на примере тирозина)
Студент должен получить представление:
1) об общих чертах метаболических процессов,
2) о важнейших источниках энергии в животном организме,
3) о значении свободнорадикального окисления как физиологического процесса,
4) о патологических состояниях, связанных с гипероксидацией,
5) о значении антиоксидантов в комплексе терапевтических мероприятий.
Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:
1) основные положения термодинамики,
2) понятия о фазовых реакциях,
3) сведения о катализе,
5) сведения о процессах фотосинтеза в клетке,
6) современная номенклатура химических соединений.
Аудиторная работа.
Лабораторная работа (Оксидоредуктазы)
Обнаружение тирозиназы в картофеле.Фермент тирозиназа (или согласно классификации моноамин: О2-оксидоредуктаза дезаминирующая) содержится в тканях растений и животных, относится к числу медьсодержащих белков, катализирует, как следует из рационального названия, окислительное дезаминирование моноаминов согласно реакции:
О2+Моноамин + Н2О→Альдегид +Аммиак + Н2О2.
В организме тирозиназа катализирует превращение адреналина в адренохром - бурый пигмент.
Ход работы. Примерно 1 г картофеля измельчить скальпелем и растереть в ступке с 3 мл дистиллированной воды. Гомогенат фильтровать через двойной слой марли - в фильтрате содержится тирозиназа.
В две пробирки внести по 1 мл фильтрата. Содержимое одной пробирки нагреть до кипения и поддерживать кипение 2 мин (инактивация фермента). В обе пробирки внести по 5 капель 0,1%-ного раствора адреналина, смешать и инкубировать при 400С, периодически встряхивая и наблюдая за изменением окраски.
Жидкость в пробирке с активным (не подвергшимся нагреванию) фильтратом розовеет, затем принимает бурую и темную окраску. Это связано с окислительным дезаминированием, приводящим к образованию пигментов. В пробирке, где фермент инактивирован кипячением, изменение окраски не наблюдается, т. е. адреналин не подвергается превращениям.
Аргументировано и кратко ответить на следующее:
1. Может ли осуществиться окисление СНЗ - СН2 - СН2 - ОН в СН3 - СН2-СН=О в бескислородной среде? Какие условия для этого необходимы? Написать схему реакции.
2. Может ли и при каком условии в бескислородной среде произойти окисление по типу СН3 - СН2 - СН=О → СН3 - СН2 - СООН? Укажите необходимые компоненты, составьте схему реакции.
3. Является ли кислород исключительным (единственным) конечным акцептором водорода в цепи тканевого дыхания и вообще в биологическом окислении? Почему эволюция «избрала» кислород в качестве конечного акцептора водорода?
4. Реакция СН3 - СН =О → СН3 - СООН осуществлена в бескислородной среде. Как объяснить появление двух атомов кислорода в продукте реакции, в то время как исходный продукт содержит только один атом кислорода?
5. Какие компоненты, необходимые для осуществления изображенной ниже реакции, отсутствуют в схеме?
СООН - СН2-- СН2 – СООН + 1/2О2 → СООН - СН = СН - СООН+Н2О.
5. Почему окисление в живой природе отождествляли с горением ?
6. Описать внешние признаки сходства между горением и процессом окисления в организме.
7. Где в организме осуществляется потребление кислорода ?
8. Назвать предпосылки, обусловившие появление теории активации водорода.
9. Сформулировать понятие «дегидрирование», определить роль кислорода и воды в биологическом окислении, протекающем как процесс дегидрирования.
10. Функция кислорода в дегидрировании (определить с помощью трёх слов).
11. Сформулировать современное положение о биологическом окислении, назвать его виды.
12. Свободнорадикальное окисление в клетке, активные формы кислорода, как ограничивается интенсивность процесса.
ЗАНЯТИЕ 8 («Тканевое дыхание, локализация
и участники процесса»)
Цель: ознакомиться с важнейшим механизмом биологического окисления – тканевым дыханием, структурой и локализацией ферментов этого процесса, с механизмами транспорта протонов и электронов по дыхательной цепи, фактором, определяющим направление переноса.
Студент должен знать:
1. В какой роли выступает в процессе тканевого дыхания окисляемый субстрат.
2. Что представляют собой акцепторы-донаторы протонов и электронов в дыхательной цепи, их структуру, последовательность взаимодействия,
3. Чем определяется направление транспорта протонов-электронов; компоненты структуры простетических групп дегидрогеназ, определяющие их способность транспортировать электроны и протоны.
4. Водородтранспортный и электронтранспортный участки дыхательной цепи, множественность форм электронтранспортных компонентов, чем отличаются неаутооксидабельные и аутооксидабельные компоненты.
5. Локализацию энзимов тканевого дыхания, последовательность их расположения во внутренней мембране митохондрии.
6. О свойстве внутренней мембраны относительно Н-ионов, структуру и роль протонного канала.
7. Значение некоторых витаминов в транспорте протонов и электронов.
8. Отличия в механизмах дегидрирования насыщенных, ненасыщенных соединений, спиртов, альдегидов, кетонов и аминокислот.
.Студент должен уметь:
1. о ведущей роли биологического окисления в поддержании энергетического обмена,
2. Опознать по структуре кофермента дегидрогеназ их место в дыхательной цепи.
3. Составить схему локализации и функционирования дыхательной цепи.
4. Изобразить схему того структурного компонента митохондрий, в котором располагаются энзимы дыхательной цепи, указать на схеме элементы протонного канала
5. Уметь изображать структурные формулы важнейших макроэргических соединений живой природы.
6. Показать на фрагментах структурных формул насыщенных и ненасыщенных соединений, спиртов, альдегидов и кетонов ход их дегидрирования.
Студент должен получить представление:
1) о значении нарушений биологического окисления в развитии некоторых патологических состояний,
3) о патологических состояниях, ведущих к нарушению энергетического обмена..
Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:
1) основные положения термодинамики,
2) представления об окислительно-восстановительном потенциале,
3) о принципах определения окислительно-восстановительного потенциала in vitro.
Аудиторная работа.
Лабораторная работа (сопоставление окислительно-восстановительного потенциала рибофлавина и метиленовой сини).
Ход работы. В пробирку внести 4 - 5 капель воды, одну каплю взвеси рибофлавина и по каплям добавлять раствор красителя «метиленовый синий» до появления синего или зеленовато-синего окрашивания раствора. Затем внести в пробирку гранулу цинка и 2 капли концентрированной соляной кислоты. Начинается выделение пузырьков водорода. По мере насыщения раствора водородом окислительно-восстановительный потенциал смеси постепенно снижается, и происходит восстановление рибофлавина и метиленового синего. Восстановление всего имеющегося метиленового синего (Е - 0,11) происходит раньше, чем восстановление значительной части рибофлавина (Е - 0,20), поэтому окраска жидкости переходит последовательно в зеленый, желто-зеленый, желтый и, наконец, бледно-желтый или розовый цвет.
Бледно-желтую жидкость слить в другую пробирку и наблюдать изменение окраски. Водород в жидкость больше не поступает, а ранее растворенный в ней водород частично уходит в атмосферный воздух, отчасти переносится через рибофлавин и метиленовый синий на кислород воздуха. В связи с этим окислительно-восстановительный потенциал, постепенно повышается. После расходования водорода в растворе начинается окисление восстановленного рибофлавина, он передает водород через метиленовый синий на кислород и приобретает желтую окраску (раствор желтеет). Затем начинается окисление восстановленного (т.е. бесцветного) метиленового синего - раствор становится вначале зеленым, а затем синим.
В протоколе работы записать схему переноса водорода в изучаемой системе.
Дать (приводя ход решения) ответы на следующие задачи
или выполнить указанные действия:
1. Соединения А, В, С, Х и Y имеют редокс-потенциалы, равные - 0,39, + 0,22, - 0,37, - 0,35, + 0,28 В соответственно.
В какой последовательности будет происходить перенос электронов в системе, включающей эти соединения (от водородного электрода)?
2. Написать реакции дегидрирования соединений:
а) R-СН2-СН2-R; б) R-СН=О; в) R-СНОН-R; г) R-СН=СН-R.
3. Какие из перечисленных соединений являются субстратом флавиновых ферментов: глюкоза, сахароза, янтарная кислота, глицериновый альдегид, НАД Н+, НАДФ Н+, глутаминовая кислота?
4. Какие из перечисленных соединений могут служить акцепторами водорода от флавиновых ферментов: О2, НАД, НАДФ, цитохромы, пировиноградная кислота, глутатион, фумаровая кислота?
5. Как изменится коэффициент полезного действия (КПД) тканевого дыхания, сопряженного с окислительным фосфорилированием, если в переносе протонов и электронов не участвуют НАД-дегидрогеназы (КПД в условия нормы принять равным 0,4)?
6. Как изменится теплопродукция органа; если при постоянной интенсивности тканевого дыхания в связи с появлением разобщающего фактора коэффициент Р/О снизился с 3 до 1?
7. Какой элемент отсутствует в уравнении:
СOOH-СН2-СН2-COOH + ? →сукцинатдегидрогеназа→ СООН-CH=CH-СООН + ?
8. Какие элементы отсутствуют в уравнениях:
а) Н2СО + ? → ? + НСООН;
б) ? + 1/2О2 ксантиноксидаза> НСООН + ?
9. Напишите химическое уравнение реакции анаэробного дегидрирования первичного спирта с учетом всех необходимых компонентов.
10. Три названных ниже продукта могут составить окислительно-восстановительную цепь: 02, глутаминовая кислота, протеин-ФМН.
Построить цепь в последовательности: донатор - промежуточный акцептор протонов и электронов - конечный акцептор.
11. Как изменится теплопродукция органа, если блокирована НАД-дегидрогеназа, но сохранена функция, других компонентов дыхательной цепи? В качестве субстрата используется глутаминовая кислота (до повреждения орган продуцировал 50 кал/мин).
12. Коэффициент Р/О исследуемой ткани снизился с 3 до 2 (с 3 до 1).
Какой процесс, на каких этапах нарушен в первом и втором случаях?
13. В пробирке создана система, содержащая неповрежденные митохондрии, обеспечивается доступ кислорода, присутствуют достаточные количества АДФ и неорганического фосфата.
Подберите из перечисленных ниже субстратов такие, окисление которых может обеспечить коэффициент Р/О, равный.2 или 3: глюкоза, глицериновый альдегид, глутаминовая кислота, НАД Н+, НАДФ Н+, янтарная кислота.
14. Как изменится концентрация неорганического фосфата и АДФ в системе, содержащей неповрежденные митохондрии и обильно снабжаемой способным к окислению субстратом: 1) в присутствии 2,4-динитрофенола, 2) в отсутствие 2,4-динитрофенола.
Аргументировать ответ
Занятие 9 (итоговое).
При подготовке к занятию в порядке самоконтроля определить с помощью следующих вопросов, усвоены ли Вами разделы «Ферменты» и «Биологическое окисление»(использовать материалы лекций, учебники).
1. Природа и свойства ферментов.
2. Номенклатура и классификация ферментов.
3. Принципы определения и выражения активности ферментов.
4. Кинетика ферментативных процессов; эффекторы ферментативных реакций (ингибиторы и активаторы);
8. Современные представления о биологическом окислении (тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование).
9. Ферменты тканевого дыхания – локализация, последовательность размещения, понятия «донатор-акцептор» протонов и электронов, водород- и эелектронтранспортные участки, конечный акцептор электронов и протонов
10. Типы дегидрирования.
11. Механизмы сопряжения и разобщения (фактор сопряжения, разобщающие факторы, коэффициент Р/О).