Объединение фрагментов ДНК
При объединении фрагментов ДНК возникают две проблемы — структурная (проблема совместимости концов объединяемых фрагментов) и концентрационная (проблема соотношения концентраций объединяемых фрагментов).
Непосредственное объединение. Без предварительной подготовки лигируют рестрикты, имеющие совместимые концы — липкие или ровные. Липкие концы объединяются в результате комплементарных взаимодействий с последующим действием ДНК-лигазы. Фрагменты ДНК с ровными концами объединяют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Ввиду низкой эффективности этой реакции концентрации ДНК и фермента при этом должны быть на порядок выше, чем при объединении липких концов. Если векторные молекулы и чужДНК обработаны одной рестриктазой или их изошизомерами, то клонируемый фрагмент можно "вырезать" из рекДНК с помощью тех же рестриктаз. Ход операций по лигированию контролируют электрофорезом в геле.
Лигирование молекул ДНК, обладающих совместимыми концами, неизбежно сопровождается их циркуляризацией вследствие объединения собственных концов, что снижает выход рекДНК. Удачный выбор концентраций ДНК уменьшает влияние этого фактора.
Ферментативная модификация концов. Модификацию концов лигируемых молекул ДНК проводят для разных целей. В частности, основное средство предотвращения циркуляризации молекул — предварительная обработка щелочной фосфатазой E.coli меньшего по размеру компонента (обычно это линеаризованный вектор), после чего концы таких молекул не замыкаются друг с другом лигазой из-за отсутствия у них фосфатных групп. В то же время клонируемый фрагмент встраивается в векторную молекулу благодаря наличию у него этих групп. Оставшиеся дефекты в рекДНК устраняются in vivo после трансформации клеток.
 |
Рис. Способ предотвращения рециркуляризации векторной ДНК с помощью фосфатазы
Частая процедура в молекулярном клонировании — переклонирование фрагмента ДНК, т. е. его перенос из одного вектора в другой. При этом обычно возникает проблема несовместимости концов фрагмента и нового вектора, которая решается несколькими способами.
В случае необходимости переклонирования используют векторы, имеющие в себе полилинкеры, или применяют линкеры и адаптеры.
Использование линкеров. Синтетические олигонуклеотиды — линкеры и адаптеры применяют для объединения фрагментов ДНК, имеющих концы различного строения, и для введения специальных последовательностей в места соединения.
Линкерами называют однонитевые самокомплементарные олигонуклеотиды, которые образуют дуплексы, имеющие ровные концы и содержащие сайты рестрикции (выделены шрифтом):
Линкеры используют также для объединения молекул ДНК, обладающих ровными концами неопределенного строения, с целью образования сайта рестрикции на стыке молекул. Для клонирования больших фрагментов ДНК удобны линкеры, содержащие сайты узнавания для редкощепящих рестриктаз.
Использование адаптеров. Адаптерами называют одно- или двунитевые олигонуклеотиды, предназначенные для объединения молекул с несовместимыми концами. У дуплексов концы разные: один конец ровный, а другой ступенчатый, либо оба конца ступенчатые. Адаптеры применяют, когда концы векторных и клонируемых молекул образованы различными рестриктазами, а также когда в клонируемых фрагментах ДНК есть сайты используемых рестриктаз.
Однонитевые адаптеры применяют для объединения молекул ДНК с 5'- и З'-выступающими концами.
Двунитевые адаптеры с различными выступающими концами способны изменять выступающие концы ДНК. Такие адаптеры называют конверсионными. Примером их может служить адаптер EcoRI-BamHI, с помощью которого Bam-НI-концы можно заменить ЕсоRI-концами и интегрировать модифицированные таким образом фрагменты ДНК в EcoRI-сайты векторов.