Палочковидные бактерии, извитые и нитчатые
План
Микроскопическое исследование различных форм бактерий.
16. Шаровидные:
а) кокки - Micrococcus aurantiacus, Streptococcus lactis;
б) сарцины - Sarcina ureae, Sarcina flava.
17. Палочковидные:
а) бактерии -Achromobacter stutzeri, Pseudomonas fluorescens;
б) бациллы - Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. mycoides.
18. Извитые:
а) вибрионы - Vibrio buccalis;
б) спирохеты - Spirochaeta buccalis.
Нитчатые: Crenothrix polyspora.
Материалы и оборудование
18. Чистые или накопительные культуры исследуемых бактерий.
19. Колонии бактерий посева из воздуха на МПА.
20. Фуксин.
21. Метиленовый синий.
22. Микроскоп.
23. Иммерсионное масло.
24. Предметные и покровные стекла,
25. Препаровальные иглы.
26. Иглы для пересева.
27. Марлевые салфетки.
28. Спиртовка или газовая горелка.
29. Штативы для предметных стекол и лотки.
Основные сведения Бактерии по своей форме делятся на четыре группы: шаровидные, палочковидные, извитые и нитчатые.
Шаровидные бактерии - кокки - имеют округлые клетки. Одиночные кокки носят название монококков (или микрококков). Часто после деления такие клетки не расходятся, а образуют группы (рис.1). Группа из двух кокков образует диплококк. Если деление провис./. Micrococcus aurantiacus. исходит все время в одном направлении
и образующиеся клетки не разъединяются, получается нить из отдельных шариков в виде цепи; эта форма носит название стрептококка. При делении в двух взаимно перпендикулярных направлениях возникает группа, состоящая из четырех кокков, - тетракокк. Если деление происходит в трех взаимно перпендикулярных направлениях
и клетки не расходятся, то образуется скопление клеток в виде пакетов (кубиков) - сарцины (рис. 2). Делясь в разных плоскостях и направлениях без особой закономерности, кокки образуют
беспорядочное скопление клеток,
напоминающее виноградные гроздья,
это стафилококки.
Бактерии палочковидной формы
составляют наиболее многочисленную группу (рис. 3-7). В классификации палочковидных форм те, которые могут Рис. 2. Sarcina flava. Правиль- образовывать споры, принято именовать ные пакеты по 8-16 клеток. , .
бациллами; палочковидные формы, не способные к спорообразованию, называют бактериями (в узком смысле этого слова). По взаимному расположению клеток среди палочковидных бактерий различают также одиночные бактерии, диплобактерии, стрептобактерии (или бациллы).
В клетке бациллы обычно образуется спора. Расположение споры может быть центральным и терминальным (на конце клетки).
Некоторые бациллы, содержащие спору, не изменяют формы клетки (бациллярный тип спорообразования), другие при спорообразовании изменяют ее. Одни приобретают вид барабанной палочки - это так называемая плек- тридиальная форма, свойственная, например, Granulobacter pectinovorum. Другие принимают форму веретена - это клостридиальная форма, характерная для Clostridium pasteurianum.
Многие палочковидные бактерии подвижны. Движение обеспечивается жгутиками у эубактерий (рис. 3, 6), пурпурных бактерий, а также у микробов некоторых других групп в определенной стадии развития (подвижная стадия).
Величина бактериальных клеток, как правило, очень мала и измеряется микрометрами (микронами). Кокки имеют размеры около 1-2 мкм в диаметре, бактерии в длину достигают в среднем 1-8 мкм, однако встречаются и более крупные - до 50 мкм (Beggiatoa mirabilis).
Такие микробы, как риккетсии, имеют размеры еще меньше, чем кокки (1-2 мкм в длину, 0,3-0,7 мкм - в поперечнике). А вирусы и фаги - еще мельче и видны лишь в электронный микроскоп.
Для знакомства с бактериями, которые имеют форму кокков, можно использовать перечисленные далее микроорганизмы. Micrococcus aurantia- cus (рис. 1) имеет одиночные клетки, иногда в парах и небольших цепочках.
Колонии красно-оранжевого или оранжевого цвета. Микроб усваивает минеральный азот, хорошо растет в синтетических и органических средах, расщепляет сахара. Встречается в почве, воде, воздухе. Sarcina ureae имеет клетки средних размеров (2-6 мкм). Колонии этого микроба достигают 4-5 мм в диаметре, окрашены в желтый или оранжевый цвет. S. ureae - аэроб, разлагает мочевину и белок.
Встречается в почве, в воздухе. Escherichia coli - кишечная палочка (рис. 6) имеет вид небольшой палочки (2-3 мкм), не образует спор; бактерия относится к группе аммонификаторов. Вас. subtilis (сенная палочка) - аэроб, аммонификатор, спороносная короткая палочка, перитрих (рис. 3). В присутствии пептона и углеводов образует ацетон, уксусный альдегид, масляную кислоту. Bas. mesentericus - небольшая (1,5-5 мкм) спороносная палочка, аэроб, аммонификатор (рис. 4). Встречается на гниющих продуктах. Вас. mycoides — небольшая палочка (1,6-3,6 мкм), образующая в центре клетки овальные споры разной величины (рис. 5). На твердых питательных средах образует характерные колонии, напоминающие грибной мицелий (отсюда и название: mycoides - грибоподобный), аммонификатор, аэроб.
Извитые формы бактерий делятся на три группы: вибрионы, спириллы и спирохеты. Все они обладают подвижностью.
Вибрионы - не гнущиеся при движении формы; клетка представляет собой как бы часть витка спирали, по форме она слегка напоминает запятую (рис. 8).
Спириллы - не гнущиеся при движении формы, клетка имеет один или большее число витков спирали (рис. 9).
Способность к движению у этих бактерий обусловливается наличием жгутиков. Характер движения зависит от положения жгутиков на поверхности клетки.
К спириллам относится пурпурная фототрофная бактерия Rhodospirillum rubrum. Этот вид характеризуется полярным жгутиковани- ем, а также наличием в хроматофорах пурпурного пигмента родопсина и бактериохлорофиллов. Однако под микроскопом в живом состоянии одиночные клетки Rhodospirillum rubrum выглядят серыми и лишь в результате скопления большого количества бактериальных клеток культуральная жидкость бывает окрашена в пурпурный цвет (рис. 8, 9).
Спирохеты - это особая группа прокариотических одноклеточных организмов. Оболочка клеток, в отличие от других бактерий, слабо ригидная, поэтому тело спирохеты способно при движении змеевидно изгибаться.
Во внутренней структуре клеток спирохет также имеется ряд отличительных черт: например, наличие аксиальной цитоплазматической нити, расположенной вдоль всего тела бактерии.
Выделяют спирохеты безвредные для человека, это, например, обитатели ротовой полости (Spirochaeta buccalis), и патогенные, которые встречаются в почве, водоемах и организмах человека и животных (Treponema pallidum).
Нитчатые бактерии. Это длинные, иногда ветвящиеся нити, включающие большое количество клеток, заключенных в трубчатое влагалище (рис. 10). Осуществляют процессы окисления соединений серы, железа, например, Beggiatoa mirabilis (ползающая бактерия), Crenothrix polyspora - железобактерия, прикрепленная к субстрату.
Ход работы
На четырех чистых предметных стеклах готовят фиксированные и окрашенные фуксином или метиленовым синим препараты культур: Вас. subtilis, Micrococcus aurantiacus, Вас. mesentericus, Sarcina flava.
Если для приготовления препаратов используют чистые культуры микроорганизмов, то следует соблюдать условия стерильности.
Фиксированные, окрашенные и промытые препараты подсушивают и рассматривают без покровного стекла с иммерсионной системой. При рассмотрении бактерий нужно обратить внимание на форму и размеры клеток. Бактерии зарисовывают и подписывают их названия.
Микроскопическое исследование зубного налета. На предметное стекло наносят каплю воды, затем спичкой или зубочисткой берут немного зубного налета, смешивают с каплей воды, приготавливают мазок, фиксируют и окрашивают фуксином. Промытый и высушенный препарат рассматривают с иммерсионным объективом. В препарате (рис. 8) видны различные формы бактерий: Streptococus albus, Вас. maximus buccaiis и другие, иногда случайные виды.
Вас. maximus buccaiis - аэроб, имеет форму длинных довольно толстых нитей. Дает колонии желтого, бледно-желтого или золотистого цвета.
Spirochaeta buccaiis - аэроб, клетки имеют вид длинных, довольно крупных спирально закрученных нитей.
Spirochaeta dentium - также спирально закрученная нить, однако более тонкая, чем S. buccaiis.
Vibrio buccalis - мелкие клетки полулунной формы, монотрих, как и все предыдущие виды, представитель нормальной микрофлоры ротовой полости.
Микроскопическое исследование навозного настоя. На предметное стекло наносят каплю навозного настоя, накрывают стеклом и рассматривают в живом состоянии при большом увеличении микроскопа с прикрытой диафрагмой (рис. 9). В препарате виды различные формы бактерий (вибрионы, спириллы, спирохеты). Движение бактерий отчетливо видно при рассмотрении их в висячей капле.
Микроскопическое исследование Crenothrix polyspora. На предметное стекло наносят каплю культуральной жидкости Crenothrix polyspora, накрывают покровным стеклом и рассматривают при большом увеличении (рис. 10).
Контрольные вопросы
1. На какие четыре основные группы делят бактерии по их форме?
2. Как отличить сарцины от стафилококков по их внешнему виду?
3. В чем различие между бактериями (в узком смысле) и бациллами?
4. Как отличить клостридиальную форму бацилл от плектридиальной?
5. Опишите характерные особенности извитых форм бактерий (вибрионов, спирилл, спирохет).
6. Какие микроорганизмы вы обнаружили в зубном налете?
Занятие 3.Запасные клеточные включения. СпорыПлан
1. Обнаружение запасных клеточных включений:
а) волютина - в клетках Saccharomyces cerevisiae;
б) гранулезы - в клетках Closridium amylobacter;
в) гликогена - в клетках Вас. mesentericus, Вас. mycoides;
г) жира - в клетках Saccharomyces cerevisiae, Azotobacter chroococcum.
2. Окраска спор по методу Циля или Пешкова у Вас. subtilis, Clostridium pasteuriabum.
Материалы и оборудование
1. Чистые культуры: Вас. subtilis, Вас. mycoides, Clostridium amylobacter, Clostridium pasteurianum, Azotobacter chroococcum, Saccharomyces cerevisiae.
2. Растворы Люголя для окраски гранулезы и гликогена (0,3% и 7 % р-ры 12).
3. Раствор краски судан III.
4. 5-процентный раствор хромовой кислоты.
5. 0,5-процентный раствор нейтрального красного.
6. Карболовый фуксин Циля.
7. 5-процентный и 1-процентный растворы серной кислоты.
8. Метиленовый синий.
9. Иммерсионное масло.
10. Микроскопы.
11. Покровные и предметные стекла.
12. Иглы и петли для пересева.
13. Препаровальные иглы.
14. Стеклянные палочки.
15. Спиртовка или газовая горелка.
16. Фильтровальная бумага.
17. Штативы для предметных стекол.
18. Лотки.
Основные сведения
В результате жизнедеятельности в клетках микроорганизмов образуются запасные включения. Сюда относятся волютин, гранулеза, гликоген, жир и другие соединения.
Волютин - запасное вещество, состоящее из неорганических веществ (полифосфатов и полиметафосфатов) и соединений, близких к нуклеиновым кислотам. Откладывается в виде гранул у бактерий в цитоплазме клеток, а у дрожжей - в вакуолях. Эти гранулы являются резервом фосфатов, за счет которых в клетках синтезируются молекулы нуклеиновых кислот, АДФ и АТФ. Волютин накапливается при выращивании бактерий в условиях хорошего питания (на глицерине с добавлением солей фосфорной кислоты). Метиленовый синий окрашивает волютин в фиолетовокрасный цвет. Поэтому существует другое название волютина - метахро- матические гранулы (метахромазия - свойство окрашиваться в цвет, отличный от цвета окрашивающего вещества).
Гранулеза - крахмалоподобное вещество, которое при гидролизе дает D-глюкозу. Гранулеза хорошо обнаруживается у маслянокислых бактерий, например, у Clostridium pasteurianum.
Клетки бывают почти целиком заполнены мелкими гранулами этого вещества. Эта бактерия образует споры клостридиальной формы. В процессе жизнедеятельности осуществляет маслянокислое брожение, фиксирует молекулярный азот.
Гликоген - крахмалоподобное вещество, имеет зернистую структуру, иногда же находится в протоплазме клетки в растворенном состоянии. Гликоген широко распространен у различных микроорганизмов: Saccharamyces cerevisiae (дрожжей), Вас. subtilis (сенной палочки) Вас. mycoides, Вас. mesentericus.
Жир как включение встречается в клетках многих микроорганизмов, его можно обнаружить в старых культурах дрожжей Saccharamyces cerevisiae.
Споры бактерий образуются при неблагоприятных условиях. Они возникают внутри бактериальной клетки и обычно имеют сферическую или овальную форму. Спора окружена толстой оболочкой, которая предохраняет ее содержимое от высыхания. Оболочка устойчива к действию большинства химических веществ, поэтому плохо окрашивается. Чтобы споры прокрасились, требуется специальная обработка препарата. Его обрабатывают (протравливают) кислотой, затем красят концентрированным раствором красителя при высокой температуре. При этом оболочки спор так прочно адсорбируют краску, что не обесцвечиваются при последующей обработке слабым раствором кислоты.
Таким образом, окраска спор производится по следующему принципу: протравливают фиксированный препарат кислотой, затем сильно прокрашивают его, вновь обрабатывают кислотой, обесцвечивая вегетативные тела бактерий и оставляя окрашенными споры, и, наконец, окрашивают вегетативные клетки в дополнительный контрастный цвет.
Ход работы
Обнаружение включений. Для обнаружения волютинана предметное стекло в каплю воды добавляют исследуемые микроорганизмы Saccharamyces cerevisiae, делают мазок, фиксируют его и окрашивают метиленовым синим. Волютиновые зерна приобретают фиолетовый или фиолетово-красный цвет, а протоплазма клеток окрашивается в голубой (рис. 11).
Для обнаружения гранулезына предметное стекло наносят взвесь бактерий Clostridium amylobacter и смешивают с каплей слабого раствора йода. Гранулеза в бактериальных клетках окрашивается йодом в темно-синий цвет.
Для обнаружения гликогена пользуются более концентрированным раствором йода. На предметное стекло наносят взвесь бактерий Вас. subtilis или другого микроорганизма и смешивают эту каплю с раствором йода. Гликоген окрашивается в красно-бурый цвет (рис. 12).
Для обнаружения жира в приготовленную на предметном стекле каплю суспензии исследуемых микроорганизмов Azotobacter chroococcum или Saccharamyces cerevisiae наносят каплю Судана III. Протоплазма клетки остается бесцветной, капли жира окрашиваются в оранжево-красный, а жиропробные вещества - в желтый цвет.
Окраска спор по методу Циля-Нильсона в модификации Мюллера. Мазок из культуры Вас. subtilis, Clostridium pasteurianum, Вас. putrificus или другой спороносной бактерии подсушивают на предметном стекле, фиксируют и наносят на него 5-процентный раствор хромовой (или серной) кислоты в качестве протравы. Препарат подогревают пять минут (до появления паров), затем сливают кислоту. После этого мазок промывают водой, покрывают фильтровальной бумагой и наносят на бумагу карболовый фуксин Циля (окраска через фильтровальную бумагу). Красят препарат в течение семи минут, периодически добавляя раствор красителя и подогревая его до появления пара или даже доводя до кипения/ По мере испарения растворителя добавляют краситель, не давая ему подсохнуть во время подогревания. Затем снимают фильтровальную бумагу, препарат промывают водой и обесцвечивают (в течение 15 сек.) 1-процентным раствором серной кислоты (быстро погружают в стаканчик или в ванночку с кислотой или наносят кислоту на препарат), после чего промывают водой. Потом окрашивают препарат метиленовым синим в течение 1 мин. (окрашиваются вегетативные клетки, обесцвеченные от фуксина кислотой). Затем препарат тщательно промывают водой, подсушивают и рассматривают с иммерсией. v
Споры окрашиваются фуксином в ярко-красный цвет, а вегетативные клетки метиленовым синим - в синий.
Окраска спор по методу Пешкова. На предметном стекле готовят мазок из культуры бацилл, высушивают и фиксируют его в пламени горелки. На мазок наливают раствор метиленового синего и, подогревая стекло, доводят его до кипения. Прогревают препарат 20 сек., затем промывают водой и докрашивают мазок 0,5-процентным раствором нейтрального красного или эозином в течение 30 сек. Снова промывают препарат, высушивают и рассматривают с иммерсионной системой. При этом бактериальная клетка окрашивается в красный цвет, а спора - в синий.
К отчету о выполненной работе прилагаются зарисовки всех рассмотренных препаратов.
Контрольные вопросы
1. Какие запасные включения можно обнаружить в клетках микроорганизмов?
2. Как формируются в клетках бацилл споры, каково их строение и биологическое значение?
3. Опишите методы окрашивания спор в клетках микробов.
Занятие 4. Методы дифференцированной окраски клеток бактерий. Обнаружение капсул
План
1. Окраска бактерий по Граму.
2. Обнаружение капсул у Azotobacter chroococcum и их окраска.
Материалы и оборудование
1. Чистые культуры Вас. subtilis, Вас. mycoides, Sacchromyces cerevisiae, Nitrozomonas sp., Chromobacter denitrificans и других микроорганизмов.
2. Свежеразбавленный раствор карболового фуксина Циля (1:10).
3. Карболовый генциановый фиолетовый.
4. 96-процентный этиловый спирт.
5. Иммерсионное масло.
6. Разбавленная тушь (1 часть туши и 10 частей воды) или раствор нигрозина.
7. Микроскоп.
8. Предметные и покровные стекла.
9. Иглы и петли для пересева.
10. Препаровальные иглы.
11. Стеклянные палочки.
12. Фильтровальная бумага.
13. Спиртовка или газовая горелка.
14. Штатив для предметных стекол.
15. Лотки.
Основные сведения
Окраска бактерий по Граму. Способ окраски по Г раму является необходимым диагностическим методом в микробиологической практике. Сущность дифференцированной окраски по Граму состоит в том, что краски трифенилметанового ряда, например, генциановый фиолетовый и йод образуют в клетках некоторых бактерий окрашенные соединения, которые не обесцвечиваются при последующей обработке препарата спиртом и сохраняют сине-фиолетовую окраску (грамположительные). Другие бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются (грамотрицательные).
Это настолько универсальный способ сложной окраски, что все бактерии по этому показателю делятся на две группы: красящиеся по Граму - грамположительные (грампозитивные) - и не красящиеся - грамотрица- тельные (грамнегативные). Отношение к окраске по Граму служит одним из основных морфологических признаков бактерий в их характеристике.
Способность бактериальных клеток окрашиваться по Граму зависит главным образом от химического состава и структуры клеточных стенок. У грамположительньгх бактерий клеточная стенка состоит в основном из муреина (до 95 %) и тейхоевой кислоты. В состав клеточной стенки гра- мотрицательных бактерий входят липопротеиды, липополисахариды, фосфолипиды и незначительное количество муреина (5 %). Отношение микроорганизмов к окрашиванию по Граму лучше проявляется у бактерий в молодых 2-3-дневных культурах.
Капсулы бактерий. Многие микроорганизмы, в том числе и бактерии, выделяют большое количество слизистых веществ. Впитывая в себя воду, эти вещества набухают и превращаются в клейкую студенистую массу, которая образует вокруг клеток слизистые чехлы, получившие название капсул. Химический состав капсулы у разных видов бактерий различен. Обычно капсулы состоят из полисахаридов (Micrococcus aurantiacus, Leuconostoc mesenteroides). Иногда капсулы содержат гликопротеиды и полипептиды (Azotobacter chroococcum).
Образование капсул зависит от условий культуры и от особенностей питания бактерий. К числу микроорганизмов, образующих капсулы, относят вышеназванные организмы, а также некоторые патогенные бактерии (например, пневмококк, палочку сибирской язвы и др.).
О наличии капсул можно судить по характерному расположению клеток, так как в этом случае клетки, окруженные капсулами, не соприкасаются друг с другом.
Для выявления капсул применяют метод микроскопирования бактерий в капле туши или нигрозина. Преимущество этого метода состоит в том, что во влажной среде можно рассматривать бактерии в живом состоянии.
Можно также рассматривать в капле тунп предварительно окрашенные бактерии (негатив ная окраска по Омелянскому).
Ход работы
Окраска по Граму. На одном предметном стекле поочередно готовят и фиксируют три мазка (рис. 13). В центре - мазок исследуемого микроорганизма, а справа и слева - контрольных: Nitrozomonas sp. (грамотрица- тельный) и Вас. mycoides (грамположительный). На фиксированные мазки кладут полоску фильтровальной бумаги и наносят сверху краситель (ген- циановый фиолетовый). Через 1-2 мин. снимают бумажку и, не промывая мазок водой, наносят на препарат раствор йода (мазок чернеет).
Через 1 мин. действуют на мазок 96-процентным спиртом: наливают спирт на предметное стекло или погружают стекло в спирт на 1 мин., затем промывают препарат водой. После промывания дополнительно окрашивают мазок раствором фуксина, через 0,5 мин. препарат промывают водой и высушивают над спиртовкой.
Готовый препарат исследуют под микроскопом с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в розовый.
Почти все патогенные кокки являются грамположительными, среди палочковидных бактерий встречаются как грамположительные, так и грамотрицательные. Большинство спорогенных бацилл окрашиваются по Граму положительно.
Обнаружение капсул. Для обнаружения капсул из чистой культуры Azotobacter chroococcum или Вас. megaterium готовят суспензию. Каплю суспензии помещают на предметное стекло, смешивают с каплей черной туши, покрывают покровным стеклом и рассматривают с иммерсионным объективом. На темном фоне препарата отчетливо видны неокрашенные крупные клетки Azotobacter chroococcum, а также заметна граница между капсулой и клеткой бактерий (рис. 14).
Для получения негативной окраски капсул по Омелянскому каплю суспензии Azotobacter chroococcum сначала смешивают на предметном стекле с каплей раствора краски (карболового фуксина или генцианового фиолетового), выдерживают 2-3 мин., затем прибавляют каплю туши, снова хорошо размешивают, размазывают по стеклу и высушивают на воздухе.
Вместо туши можно использовать 10-процентный раствор нигрозина, который окрашивает общий фон в черный цвет.
Препарат рассматривают с иммерсией. В поле зрения микроскопа на черном фоне отчетливо видны окрашенные в розовый или фиолетовый цвет клетки бактерий, вокруг которых видны светлые неокрашенные капсулы в виде различной величины ободков.
К отчету о выполненной работе должны быть приложены рисунки полученных препаратов, описания микроорганизмов и методики окрашивания.
Контрольные вопросы
1. В чем заключается сущность метода окраски по Г раму?
2. Каковы различия в химическом составе и структуре клеточных стенок у грам положительных и грамотрицательных бактерий?
3. Из каких веществ состоят капсулы бактериальных клеток?
4. Каковы методы обнаружения капсул?
Тема 3. АНАЛИЗ МИКРОФЛОРЫ ВОЗДУХА, ВОДЫ И ПОЧВЫ
Занятие 5: Микробиологический анализ сред: воздуха - методом осаждения, воды и почвы - методом разбавления
План
1. Подсчет колоний микроорганизмов в чашках Петри с посевом из воздуха.
2. Учет численности микроорганизмов на агаровых пластинках с посевом из воды или почвы при разных разбавлениях.
3. Микроскопическое изучение микробов воды, почвы и воздуха.
4. Пересев микроорганизмов для получения чистых культур.
Материалы и оборудование
1. Чашки Петри с посеянными на предыдущем занятии культурами микробов из воздуха, воды и почвы.
2. Пробирки с питательной стерильной средой для пересева.
3. Микроскопы.
4. Предметные и покровные стекла.
5. Иглы и петли для пересева.
6. Ручной бокс для пересева.
7. Спиртовка.
8. Метиленовый синий.
9. Фуксин.
10. Иммерсионное масло.
11. Штатив для предметных стекол.
12. Лотки.
13. Карандаш по стеклу.
14. Ручные лупы.
15. Колбы на 100мл.
16. Пробирки.
Основные сведения Итоги опытов по учету микрофлоры воздуха, воды или почвы с посевами на питательные среды подводятся через 6-7 дней после их заложения. Все это время чашки Петри или пробирки с посевами должны находиться в термостате при температуре, указанной для данного опыта.
Колонии рассматривают через стекло, не открывая чашку Петри. Если колоний немного, их считают на всей поверхности агар-агара чашки Петри. При большом количестве колоний чашку Петри кладут на лист черной бумаги, разделенный на 4 - 6 секторов, и считают количество колоний в каждом секторе. При подсчете и рассмотрении колоний рекомендуется использовать лупы.
Описание колоний микробов, выросших на питательной среде, проводят по следующим показателям: форма (округлая, неправильная); поверхность (гладкая, блестящая, шероховатая, сухая, складчатая); край (ровный, волнистый, городчатый); цвет; размер (диаметр).
Следует отметить, что метод подсчета колоний в чашках Петри с посевом из воздуха дает лишь приблизительные данные. Учитываются лишь микробы быстро оседающей пыли, кроме того, на твердой поверхности агар-агара прорастут только аэробные и факультативно анаэробные формы микроорганизмов. Надо учесть еще и то, что мясопептонные агаровые пластинки не являются универсальной питательной средой для микроорганизмов, на ней прорастут лишь отдельные виды микробов. Считают, что этим методом определяется от 30 до 60% микроорганизмов и спор, содержащихся в воздухе.
Более точный количественный учет микрофлоры воздуха, особенно в закрытых помещениях, производится с применением специальных приборов.
Для изучения морфологии и физиологии микроорганизмов используют чистые культуры. Существуют различные методы получения чистых культур микроорганизмов. Чистая культура может быть получена из отдельной колонии или одной клетки. Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов до настоящего времени является метод, предложенный Р. Кохом. Чистую культуру получают из одной бактериальной клетки, из которой (предположительно) развивается одна колония. При этом производят многократные пересевы бактерий из отдельных колоний или накопительных (элективных) культур на питательные стерильные среды.
Аэробные микроорганизмы могут расти на поверхности плотных питательных сред, а также жидких - при постоянной аэрации или встряхивании питательной среды (глубинный способ выращивания).
Анаэробные бактерии культивируют без доступа кислорода. Их выращивают под большим слоем жидкой питательной среды или в плотной толще.
Ход работы
Питательную среду, подготовленную и простерилизованную на предыдущем занятии, надо перенести в стерильные чашки Петри. Стерильный питательный мясопептонный агар (МПА) расплавляют, погрузив пробирки на 20-25 мин. в водяную баню с горячей водой. Двумя пальцами левой руки (средним и указательным) вынимают из пробирки пробку, большим пальцем и мизинцем этой же руки приподнимают крышку заранее подготовленной стерильной чашки Петри так, чтобы в щель между крышкой и чашкой могла пройти верхняя часть пробирки, быстро выливают расплавленный агар-агар и закрывают чашку Петри. Слегка покачивая чашку, распределяют среду равномерно по ее дну и оставляют стоять на ровной поверхности.
Когда агар-агар полностью остынет и затвердеет, производят посев микроорганизмов и спор из воздуха. Для этого приготовленные чашки Петри (2-3) размещают в разных местах исследуемых помещений и на 5 мин открывают крышки. При этом микроорганизмы и споры, содержащиеся в воздухе, постепенно осаждаются на открытой поверхности агар-агара. Крышки закрывают, на торцовой их части восковым карандашом отмечают, кто и где производил посев.
Чашки Петри заворачивают в бумагу и помещают в термостат на 7 дней при температуре 23- 26°С. В термостате чашки Петри держат крышками вниз, чтобы конденсирующаяся влага не смачивала посева (рис. 15).
Можно поставить следующий опыт: произвести посев из воздуха в одних и тех же условиях в четыре чашки Петри; одну из них оставить для контроля, в другую влить
30. мл. раствора пенициллина или другого антибиотика, в третью положить немного растертого лука или чеснока (фитонциды), а четвертую в раскрытом виде подвергнуть облучению ультрафиолетовыми лучами под кварцевой лампой (расстояние от лампы - 20-30 см, время облучения - 20 мин.). Под действием ультрафиолетовых лучей гибнут микроорганизмы, но не их споры.
На питательный агар-агар в чашках Петри после посева из воздуха можно разложить диски из фильтровальной бумаги, пропитанной раствором каких-либо антибиотиков (пенициллина, стрептомицина и пр.). Расстояние между дисками должно быть 2-3 см, в этом случае можно выявить действие различных антибиотиков на микроорганизмы.
Выращивание колоний микроорганизмов почвы на твердых питательных средах методом разбавления. Сущность метода заключается в нанесении почвенной суспензии с микроорганизмами на поверхность твердой питательной среды. Учет количества микроорганизмов проводят по числу развивающихся колоний, предполагая, что одна микробная клетка дает начало одной колонии.
Готовят твердую стерильную питательную среду из МПА в чашках Петри. Берут 10 г почвы, вносят в колбу с 90 мл стерильной воды, хорошо встряхивают, получают первое разбавление 0,1. Взяв из первой колбы 1 мл в пробирку с 9 мл воды, получают разбавление 0,01, так можно получить несколько разбавлений до 0,000001. Из каждого разбавления, тщательно взболтав, берут по 0,1 мл жидкости и выливают в отдельные чашки Петри (рис. 16). На боковой стенке чашки Петри отмечают степень разбавления. Все чашки ставят в термостат сначала при температуре 30°С, а затем при 20-23°С на 3-5 дней. Выросшие колонии анализируют и при необходимости определяют микроорганизмы до рода или вида (рис. 17).
Выращивание микроорганизмов почвы методом обрастания стекол по Н.Г. Холодному. Чтобы вырастить микроорганизмы почвы по методу
Н.Г. Холодного, в исследуемую почву закапывают стерильные предметные стекла и оставляют их на несколько недель. Вскоре поверхность стекол покрывается тонким слоем почвенного раствора, на нем и поселяются микроорганизмы. На поверхности стекол формируются характерные для данной почвы микропейзажи.
Стекла можно закопать в почву в природных условиях, в цветочных горшках или сосудах с почвой. Для этого в почве ножом делают глубокий вертикальный разрез, в который опускают стекло, оно должно быть погружено в почву на 3-5 см ниже поверхности. Почву систематически поливают.
Выращивание микроорганизмов воды. Берут питательную среду МПА в чашках Петри и воду из различных водоемов: речки, колодца, болота, лужи, - а также водопроводную, кипяченую.
31. 5 мл воды выливают на питательную среду в чашке Петри, закрывают крышку, осторожно покачивая чашку, распределяют воду по поверхности питательной среды. Чашку надписывают и ставят на проращивание.
Учет численности бактерий в воде или почве методом питательных пластин (метод Коха). Сначала готовят суспензию почвы или пробу воды методом разбавления. Подготовленные стерильные колбы и пробирки с водой нумеруют по порядку и ведут постепенное разбавление почвенной суспензии и воды по следующей схеме: 1мл исследуемой воды или 1 г почвы переносят в колбу №1 (99 мл стерильной воды), получают первое разбавление до 0,01. Содержимое колбы взбалтывают, стерильной пипеткой отбирают по 1мл в пробирку №1 (9мл стерильной воды),получают разбавление 0,001, и в колбу №2 (99мл воды) - разбавление 0,0001. Из колбы №2 отбирают по 1 мл в пробирку №2 и колбу №3, получая последние разбавления - 0,00001 и 0,000001 соответственно. Каждый отбор проводят стерильной пипеткой.
После тщательного взбалтывания содержимого всех сосудов берут из каждого по 0,1мл. жидкости и выливают в чашки Петри на теплый стерильный МПА. Чашки маркируют и ставят в термостат сначала при температуре 30°С, а затем при 20 — 23°С на 7 дней. Через 48 часов проводят предварительный, а через 7 дней окончательный подсчет числа выросших колоний.
Иногда может оказаться так много колоний, что они сливаются между собой, особенно в первых разведениях, а в последних - единичные. Поэтому при подсчете цифры могут сильно отклоняться и результат будет недостоверным. Для правильного учета подсчитывают только чашки, в которых колоний больше 10, но не более 200.Чашки просматривают в проходящем свете и отмечают подсчитанные колонии тушью, чтобы не считать дважды. Для подсчета большого числа колоний (более 200) используют счетную камеру Вольфлюгеля. Перевернутую чашку помещают на подставку камеры и накрывают стеклянной пластиной с нанесенными на нее квадратными сантиметрами. Число колоний подсчитывают в 20 - 25 квадратах в разных местах чашки, выводят среднее арифметическое и пересчитывают на всю площадь чашки.
Пример расчета: в чашке Петри №5 с разбавлением 1:1000000 выросло 6 колоний. Из одной микробной клетки или споры вырастает одна колония. Количество микробов (А) в 1г почвы или в 1мл воды рассчитывается по формуле: 
где 1мл - количество суспензии, вылитой в одну чашку Петри при закладке опыта.
На основании полученного результата делают выводы о степени загрязненности воды или о насыщенности почвы микроорганизмами.
Подсчет количества колоний в чашке Петри при прямом посеве из воздуха. Рассматривают в чашках Петри колонии: ориентировочно определяют, к какой группе микроорганизмов относится та или иная из них, описывают наиболее интересные группы колоний (их форму, цвет, очертания краев, поверхность и т.д.).
Подсчитывают число колоний в чашках Петри и рассчитывают количество микробов в Юл воздуха. По приблизительным подсчетам (Оме- лянский), на площади в 100см2 в течение 5мин. оседает столько микроорганизмов и спор, сколько их содержится в Юл воздуха. Допускаем, как и в предыдущих расчетах, что каждая колония вырастает из одной клетки или споры.
Пример расчета: в чашках Петри обнаружено в среднем по 15 колоний; радиус чашки Петри - 5 см, площадь - 3,14 • 25см2 = 78,5см2.
Количество микроорганизмов или спор (А) в 10 л воздуха рассчитывается так: 
Произведя расчеты, выясняют различия в количественном составе микрофлоры тех помещений, где производился посев из воздуха. Устанавливают влияние антибиотиков и ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы.
Если ставились опыты с антибиотиками, фитонцидами или ультрафиолетовым облучением, делаются выводы о том, как влияют на рост колоний указанные факторы.
Микроскопическое исследование микроорганизмов из наиболее интересных колоний, выросших в чашках Петри. Приготавливают фиксированные и окрашенные препараты и рассматривают их с иммерсионным объективом. Определяют, к какой группе относятся обнаруженные микроорганизмы (кокки, палочки, сарцины, дрожжи, грибы), устанавливают, как они красятся по Г раму.
Пересев микроорганизмов на стерильные питательные среды для получение чистых культур. Пересев производится в непосредственной близости от горящей горелки, лучше в специальных микробиологических камерах или боксах, чтобы сохранить чистую культуру. Заранее разогревают на водяной бане несколько пробирок со стерильной питательной средой до полного расплавления агар- агара. Укладывают пробирки на столе в наклонном положении для того, чтобы после застывания агар-агара получить косую поверхность. Когда среда застынет, производят посев микроорганизмов стерильными микробиологическими иглами и петлями; на косую поверхность агар-агара делают посев штрихом с помощью петли, на прямую поверхность - уколом иглы.
Для посева штрихом готовят пробирки с косой поверхностью агар- агара. Чашку Петри, из которой будут производить посев бактерий, ставят слева, иглу берут в правую руку. В левую руку между указательным и средним пальцами, так, чтобы скошенная поверхность агар-агара была хорошо видна, помещают пробирку, а большим и безымянным пальцами этой руки придерживают крышку чашки Петри; петлю прокаливают в пламени горелки. Левой рукой (большим и безымянным пальцами) приподнимают крышку чашки Петри и петлей прикасаются к поверхности колонии. Безымянным пальцем и мизинцем правой руки вынимают пробку из пробирки и, не выпуская пробки из руки, петлей с кусочком культуры осторожно проводят по поверхности агар-агара в пробирке. Вынимают петлю, стерилизуют ватную пробку в пламени горелки, закрывают пробирку и вновь стерилизуют петлю.
Для посева уколом готовят пробирки с прямой поверхностью агар- агара и иглу. Всю операцию повторяют так же, как и в первом случае, только иглу после прокалывания и захвата пересеваемой колонии микробов вводят в глубь питательной среды, насколько позволяет длина ее металлической части.
После посева в течение 7 дней пробирки выдерживают в термостате при температуре 25-30 °С, в дальнейшем чистые культуры микроорганизмов в пробирках хранят при температуре 2-4°С в холодильнике.
Колонии, выросшие в пробирках, через неделю после посева рассматривают и делают вывод о чистоте посева. Устанавливают, принадлежат ли они к аэробным, анаэробным или факультативно-анаэробным микроорганизмам. В первом случае колонии разовьются только на поверхности, во втором - только в глубине агар-агара, в третьем - по всей поверхности укола в агар-агар.
Отчет о проделанной работе должен состоять из ее описания и зарисовок колоний, выросших в чашках Петри и после пересева.
Контрольные вопросы
1. Как произвести анализ микрофлоры методом разбавления?
2. Какие методы используются для анализа микрофлоры воды и почвы?
3. Как произвести подсчет количества бактерий в 1л воздуха? Насколько точным может быть такой подсчет?
4. Как получают чистые культуры микроорганизмов?
5. Как по чистой культуре можно установить, является ли микроорганизм аэробным или анаэробным?
Тема 4. ПРЕВРАЩЕНИЯ БЕЗАЗОТИСТЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПОД ВЛИЯНИЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ
Занятие 6.Выращивание культур микроорганизмов,