ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ МЕРОПРИЯТИЙ 4 страница
термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят
пробирки в термостат на 20-30 минут в зависимости от гемолиза
эритроцитов в контролях.
2-я схема постановки РСК (по Fiset).
Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции -
0,6 мл, упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при
температуре +4°С 16-18 часов не в день постановки реакции, 1-2
раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией
эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских
свинок и хранящегося при температуре не выше +-20°С (однако
размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).
Титрование комплемента.
Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия
сухого комплемента содержимое ампулы растворяют в 10 мл
физиологического раствора), из которого по схеме получают
последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).
Таблица 4
-----------------------------T-----------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Разведения комплемента ¦
¦ +-----T-----T-----T-----T----T------+
¦ ¦1:15 ¦1:18 ¦1:20 ¦1:25 ¦1:30¦и т.д.¦
+----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+------+
¦Комплемент 1:10 (мл) ¦ 1 ¦ 1 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦0,5 ¦ ¦
+----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+------+
¦Физиологический раствор (мл)¦ 0,5 ¦ 0,8 ¦ 0,5 ¦ 0,75¦1,0 ¦ ¦
L----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+-------
Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл
его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу
использованных в РСК антигенов) (таблица 5).
Таблица 5
----------------------------T------------------------------------
¦ Ингредиенты реакции ¦ Разведение комплемента ¦
+---------------------------+------------------------------------+
¦ Контрольный ряд (оценка качества комплемента) ¦
+---------------------------T----T----T----T----T----T----T------+
¦ ¦1:10¦1:15¦1:18¦1:20¦1:25¦1:30¦и т.д.¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦Комплемент в различных¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦
¦разведениях (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦Физиологический раствор¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦Гемолитическая система (мл)¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦Оценка результата ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ ¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦ Опытный ряд (оценка антикомплементарных свойств антигена) ¦
+---------------------------T----T----T----T----T----T----T------+
¦Комплемент в различных¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦
¦разведениях (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦Антиген в рабочей дозе (мл)¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦Физиологический раствор¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦Гемолитическая система <*> ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+
¦Оценка результата ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦+++ ¦ ¦
L---------------------------+----+----+----+----+----+----+-------
--------------------------------
<*> - Добавляют на второй день титрования комплемента (после
16-18 часов экспозиции при температуре + 4°С).
Дозу комплемента с антигеном, дающую полный гемолиз, считают
за титр комплемента или "полную единицу", в данном примере она
соответствует разведению комплемента 1:20. Раз оттитрованной
рабочей дозой комплемента можно пользоваться в течение месяца при
работе с этой серией комплемента и эритроцитов.
После 30-минутной экспозиции при температуре +37°С учитывают
результаты.
При постановке реакции "холодным методом" (0°С) рабочая доза
комплемента соответствует двум полным единицам в виде удвоенного
объема комплемента - 0,2 мл. Например, полный гемолиз в опытном
ряду, т.е. в присутствии антигена, отмечен в пробирке при
разведении комплемента 1:20, а в контрольном ряду - 1:25. В итоге
рабочая доза комплемента при использовании в реакции данного
антигена соответствует разведению 1:20 в объеме 0,2 мл, поскольку
в этих условиях не выявляются антикомплементарные свойства
антигена. Например, на 100 пробирок необходимо приготовить 20 мл
разведенного 1:20 комплемента (из расчета 0,2 мл на пробирку),
следовательно, нужно взять 1,0 мл цельного комплемента и 19,0 мл
физиологического раствора.
В случае, если в реакции используют не 1, а 2 или 3 разного
вида антигенов, то и титрование комплемента проводят в присутствии
всех видов антигенов, после чего выбирают соответствующие дозы
комплемента.
При постановке реакции при +37°С рабочая доза комплемента
составит 1 полную единицу, т.е. объем его не 0,2, а 0,1 мл и общий
объем РСК в этом случае будет 0,5 мл.
В основном опыте контролируют рабочую дозу комплемента, полную
единицу комплемента и ее половину ("холодное" связывание) или
полную единицу комплемента и ее половину (связывание при +37°С).
Иными словами, в первом случае: 0,2 мл комплемента в рабочей дозе
+ 0,2 мл физиологического раствора; 0,1 мл комплемента в рабочей
дозе + 0,3 мл физиологического раствора, и 0,05 мл комплемента в
рабочей дозе + 0,35 мл физиологического раствора. В 1 и 2-ом
контролях должен наблюдаться полный гемолиз, в 3-ем - задержка его
на три-два креста. Во 2-м случае (т.е. связывание при +37°С) для
контроля используют 2 последние дозы.
Постановка основного опыта.
Инактивированные испытуемые сыворотки разводят физиологическим
раствором и разливают в пробирки (или лунки полистероловых
панелей) по 0,1 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток
добавляют по 0,1 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей
дозе.
Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:
1} контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сывороток, в
исходном разведении + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл
физиологического раствора);
2} контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,2 мл комплемента в
рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);
3} контроль комплемента (как указано выше);
4} контроль гемолитической системы (0,4 мл физиологического
раствора).
Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт
заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями.
Положительную сыворотку разводят до ее титра. После тщательного
встряхивания пробирки ставят в холодильник при 0°С на 16-20 часов
(1-й этап реакции, таблица 6).
Таблица 6
СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ОПЫТА РСК
------------T-------------------------------------T-----T-----T-----T-----
¦ ¦ Разведение сывороток ¦Конт-¦Конт-¦Конт-¦Конт-¦
¦Ингредиенты¦ ¦роль ¦роль ¦роль ¦роль ¦
¦ реакции +----T----T----T----T-----T-----T-----+сыв. ¦анти-¦ком- ¦гем. ¦
¦ ¦1:10¦1:20¦1:40¦1:80¦1:160¦1:320¦1:640¦ ¦гена ¦плем.¦сист.¦
+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦ 1-й этап ¦
+-----------T----T----T----T----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----+
¦Сыворотка ¦ ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Антиген ¦ ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Комплемент ¦ ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Физиологи- ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,2 ¦ - ¦
¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦ Экспозиция 16-20 часов при + 4°С ¦
+-------------------------------------------------------------------------+
¦ 2-й этап ¦
+-----------T----T----T----T----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----+
¦Гемолитиче-¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
¦ская систе-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ма (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Физиологи- ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦
¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦ Экспозиция 20-30 минут при + 37°С ¦
L--------------------------------------------------------------------------
На втором этапе в каждую пробирку или лунку панелей добавляют
по 0,2 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в
термостате при + 37°С 30 минут. Пробирки или панели тщательно
встряхивают и ставят в термостат на 20-30 минут в зависимости от
гемолиза эритроцитов в контролях. В пробирки с заведомо
положительной сывороткой и в контроле гемолитической системы
должна наблюдаться задержка гемолиза.
Оценка главного опыта заключается в степени задержки гемолиза
в пробирках с испытуемыми сыворотками по сравнению с
соответствующими контролями, в которых возник полный гемолиз.
Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение,
характеризующееся задержкой гемолиза не менее чем на три креста.
Результаты реакции считают достоверными, если в контролях
испытуемых сывороток, в контроле антигена и рабочей дозе
комплемента имеется полный гемолиз, а в контроле гемолитической
системы гемолиз отсутствует. Диагностический титр может считаться
1:10 при условии нарастания титра в 4 раза (и более) с интервалом
в 7 дней.
В РСК оба ингредиента используются в дозе, равной 1 ЕД. Дозы
определяют путем перекрестного ("шахматного") титрования.
2.4. Реакция агглютинации с риккетсиями Провачека (РА).
Реакция агглютинации (РА) является наиболее простым тестом и
может быть применена для лабораторной диагностики не только
сыпного тифа, но и большинства риккетсиозов. Вместе с тем для ее
постановки необходимы дорогостоящие тщательно очищенные
корпускулярные риккетсиальные антигены.
Ее преимуществом является минимальное число компонентов
реакции (исследуемая сыворотка и антигенный диагностикум) и более
раннее выявление агглютининов.
Метод обладает, вместе с тем, существенными недостатками:
1) для исследований пригодны только свежие негемолизированные
сыворотки, хранящиеся не более 14 дней;
2) затруднена ретроспективная диагностика, поскольку
агглютинины выявляются менее продолжительное время после болезни;
3) в случае использования бесцветного антигена - субъективизм
при оценке результатов.
Ингредиенты реакции: 1) исследуемая инактивированная при +56°С
в течение 30 минут прозрачная, свежая сыворотка, 2) корпускулярный
антиген, 3) физиологический раствор.
РАР выполняется в макро- (0,4 мл; 6 капель - по Мосингу) и
микровариантах (0,05 мл) всегда объемным способом, что ведет к
разбавлению вдвое начального разведения сыворотки (например,
сыворотка, разведенная 1:10 в объеме 3 капель, при добавлении
антигена в объеме 3-х капель будет иметь разведение 1:20).
Для микроварианта РА используют бесцветные корпускулярные
антигены, которые разводят согласно этикетке на ампуле, и жидкий
антиген коричневого цвета, приготовленный из риккетсий Провачека,
культивируемых в кишечнике вшей (для РАР может быть использован
также сухой люминесцирующий диагностикум из риккетсий для ИФРМА).
Постановка РА. Макровариант.
Готовят в агглютинационных пробирках или пластинах
последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки с 1:5
в объеме 0,2 мл или 3-х капель. С этой целью вносят во все
пробирки, кроме первой, по 0,2 мл физиологического раствора (или
по 3 капли). В отдельной пробирке или лунке готовят исходное
разведение сыворотки (1:5), т.е. 0,1 мл сыворотки + соответственно
0,4 мл физиологического раствора. Из него 0,2 мл (3 капли) вносят
в первую пробирку или лунку, 0,2 мл (3 капли) - во вторую и 0,2 мл
(3 капли) - в контрольную. Затем из 2-й пробирки после
перемешивания сыворотки и физиологического раствора 0,2 мл (3
капли) переносят в следующую и так до конечного разведения. Первое
разведение сыворотки (1:5) после добавления антигена будет
соответствовать 1:10, о чем делается надпись на пробирке или лунке.
После окончания разведения всех сывороток во все разведения
сывороток добавляют антиген (за исключением контроля сыворотки) по
0,2 мл (3 капли), встряхивают штативы с пробирками или панели
(продувая воздух в пластины из пипетки) и оставляют на 16-18 часов
при +37°С (пластины покрывают стеклом во избежание подсыхания
ингредиентов).
Постановка РА предусматривает контроль каждой исследуемой
сыворотки: 0,2 мл (3 капли) начального ее разведения + 0,2 мл (3
капли) растворителя; контроль антигена: 0,2 мл (3 капли) антигена
+ 0,2 мл (3 капли) растворителя, а также ставят контроль
стандартной специфической сыворотки с известным титром антител.
Последнюю разводят на одно разведение выше указанного на этикетке
титра (табл. 7).
Таблица 7
СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
---------------T-------------------------------------T-----------
¦ Ингредиенты ¦ Разведения исследуемой сыворотки ¦ Контроли ¦
¦ +----T----T----T----T-----T-----T-----+-----T-----+
¦ ¦1:10¦1:20¦1:40¦1:80¦1:160¦1:320¦1:640¦сыво-¦анти-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ротки¦гена ¦
+--------------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Сыворотка (мл)¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦
+--------------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Антиген (мл) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦
+--------------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Физ. раствор ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L--------------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+------
После термостата штативы выдерживают два часа при комнатной
температуре, не встряхивая пробирки, поскольку образуемый
агглютинат имеет вид нежного перевернутого зонтика и очень легко
разрушается. После этого учитывают результаты реакции.
Учет результатов.
Результаты реакции учитываются невооруженным глазом или с
помощью агглютиноскопа по 4-х крестной системе:
- полное просветление жидкости над осадком, имеющим вид
перевернутого зонтика - четыре креста (++++);
- неполное просветление жидкости над таким же осадком - три
креста (+++);
- мутная жидкость при наличии небольшого зернистого осадка на
дне и стенках пробирки - два креста (++);
- мутная жидкость, возможен осадок в виде точки - один крест
(+).
Реакция считается положительной при наличии интенсивности
агглютинации риккетсий на три креста в конечном разведении; в
контролях сывороток и антигена не должно быть агглютинации, а титр
стандартной сыворотки должен соответствовать указанному на
этикетке (допускается изменение титра на одно разведение).
2.5. Определение специфических антител к риккетсиям Провачека
иммуноферментным методом.
Принцип иммуноферментного анализа (ИФА) основан на образовании
иммунного комплекса специфических антител с антигеном,
иммобилизированном на полистероловом планшете, с последующим его
выявлением антивидовым коньюгатом, меченым ферментом.
Ферментативная активность пропорциональна содержанию специфических
антител в сыворотке и проявляется при помощи субстратов для
данного фермента.
Иммуноферментный метод обладает рядом существенных преимуществ
перед традиционными иммунологическими реакциями, главным из
которых является высокая чувствительность, специфичность,
возможность получения количественных данных, воспроизводимость,
стандартизация основных ингредиентов анализа, исследование сильно
загрязненных образцов, возможность автоматизации всех этапов
постановки.
Метод ИФА применяют для серодиагностики эпидемического сыпного
тифа и болезни Брилла, как наиболее чувствительный и позволяющий
выявить инфекцию независимо от ее клинической выраженности.
1.Ингредиенты реакции, необходимые для постановки ИФА.
1.1. Коммерческие цельнорастворимые антигены р. Провачека для
РСК.
1.2. Положительная сыпнотифозная контрольная сыворотка
человека (К+).
1.3. Сыворотки людей, не содержащие антигены к риккетсиям
Провачека (К-).
1.4. Буфер адсорбции или присоединения, рН 9,5-9,7
1.5. Буфер инкубации или разведения, рН 7,2-7,4
1.6. Буфер промывки, рН 7,2-7,4
1.7. Субстрат-индикаторный раствор, рН 5,5-6,0
1.8. Антивидовой конъюгат-антитела диагностические против
иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой, сухие
(производство НИИЭМ им. Гамалеи РАМН)
1.9. Серная кислота (Н2SО4).
2. Оборудование.
2.1. Пипетки стеклянные на 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл.
2.2. Микропипетки стеклянные на 0,1 мл, 0,2 мл.
2.3. Автоматические пипетки Р-20 (на 20 мкл), Р-200 (на 200
мкл), Р-1000 (на 1000 мкл).
2.4. Химические колбы и пробирки.
2.5. Бутылки на 3 л и 5 л.
2.6. Весы технические с разновесами.
2.7. Весы торзионные или аналитические с разновесами.
2.8. рНметр.
2.9. Резиновые груши.
2.10. Планшеты для иммунологических реакций однократного
применения.
2.11. Холодильник бытовой.
2.12. Бумага фильтровальная.
2.13. Термостат.
2.14. Фотометр.
3. Реактивы.
3.1. Карбонат натрия (Na2CO3)
3.2. Бикарбонат натрия (NaНCO3)
3.3. Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NaН2РO4х2Н2О).
3.4. Натрий фосфорнокислый двузамещенный (NaНРO4х12Н2О).
3.5. Хлористый натрий (NaCl).
3.6. Твин 20.
3.7. Лимонная кислота.
3.8. 3% раствор перекиси водорода (Н2О2).
3.9. Орто-фенилендиамин (ОФД).
3.10. 1н раствор серной кислоты (Н2SО4).
3.11. Вода дистиллированная.
Подготовка ингредиентов реакции.
Антиген разводят в 0,05М карбонат-бикарбонатном буфере, рН
9,5-9,7 (буфер присоединения) в раститровке. Рабочее разведение
подбирают "шахматным" титрованием антигена, антител
(положительного и отрицательного контроля) и конъюгата.
Для каждой новой серии антивидового конъюгата, антигена или
при смене полистероловых планшетов одной фирмы на другую
необходимо снова опытным путем ("шахматное" титрование) подобрать
оптимальные разведения антигена и конъюгата, которые станут
рабочими. Сыворотки разводят в 0,02М фосфатно-солевом буфере, рН
7,2-7,4 содержащем, 0,1% детергента (твин 20) для уменьшения
неспецифической реакции (буфер инкубации). В качестве буфера
промывки используют буфер инкубации.
Антивидовой конъюгат разводят в 0,02М фосфатно-солевом буфере,
содержащем 0,1% твин 20 и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА)
для уменьшения неспецифической сорбции конъюгата на полистирол,
сенсибилизированный антигеном. Необходимо помнить, что при
разведении конъюгата перемешивать раствор надо осторожно, не
вспенивая его, так как это приведет к денатурации фермента.
Субстрат для пероксидазы (ОФД) разводят в 0,1М
цитратно-фосфатном буфере рН5.5-6,0 незадолго до использования не
более чем за 30-60 минут до использования.
Все буферные растворы готовят заранее и хранят при температуре
+4°С. Буфер с твином не хранится на холоде и используется в тот же
день при комнатной температуре. Исходный раствор коммерческого
цельнорастворимого антигена в стерильном физрастворе хранят около
месяца при температуре +4°С.
К исходному раствору коммерческого конъюгата (антитела
диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые
пероксидазой) добавляют равный объем стерильного глицерина, в
качестве антифриза и хранят на холоде -10°С до срока годности,
указанного на ампуле.
Пероксидаза отличается способностью активировать перекись
водорода таким образом, чтобы она в присутствии окисляющихся
веществ (ОФД) отдала им один атом кислорода. В отсутствие
окисляющихся веществ, пероксидаза не разлагает перекись водорода.
Поэтому активность пероксидазы определяют в среде, содержащей
0,04% ОФД и 0,04% перекиси водорода в 0,1М цитратно-фосфатном
буфере рН 5,5-6,0, инкубируя в течение 30 минут, реакцию
останавливают добавлением равного объема 1Н серной кислоты,
определяя оптическую плотность при 492нм на фотометре.
Готовят субстрат - индикаторный раствор непосредственно перед
внесением на планшет, добавляя в раствор ОФД в 0,1М
цитратно-фосфатном буфере рН 5,5-6,0 свежеприготовленную из
пергидроли (33%-50%) 3% перекись водорода, перемешивают и быстро
разливают в лунки планшета, после чего планшет помещают в темное
место, или тщательно прикрывают, оставляя инкубироваться при
комнатной температуре. Оставшийся субстрат-индикаторный раствор
должен оставаться бесцветным в течение 30 минут при комнатной
температуре. Если раствор субстрата начинает менять окраску в
желтый цвет различных оттенков (от светло-желтого до
коричнево-оранжевого), это говорит об окислении ОФД разлагающейся
перекисью водорода под воздействием шероховатой, плохо промытой от
щелочи стеклянной посуды. Необходимо отметить, что при длительном
хранении перекиси водорода в стеклянной емкости происходит ее
медленное разложение под влиянием следов щелочи, которые попадают
в раствор вследствие растворения стекла. Чистые, без всяких
добавок, растворы перекиси водорода сохраняют в парафинированных
сосудах при комнатной температуре, в этих условиях скорость
разложения перекиси водорода равна нулю.
Постановка реакции.
В лунки планшета вносят коммерческий антиген в раститровке или
в рабочем разведении по 0,1 мл (100 мкл).
Планшеты закрывают крышкой и оставляют на 16-18 часов при +4°С
(это можно сделать за день до всего объема работы) или помещают в
термостат при +37°С на 2 часа для сенсибилизации лунок планшета
антигеном.
Содержимое лунок интенсивно встряхивают, а лунки заливают до
верха буфером промывки, содержащим 0,1% твин-20. Инкубируют 5
минут при комнатной температуре, встряхивают, подсушивают,
интенсивно постучав о фильтровальную бумагу, и вновь повторяют
процедуру промывки (3 раза).
После последней промывки планшет тщательно высушивают,
интенсивно постукивая о фильтровальную бумагу (или чистое
полотенце), так чтобы на дне лунок не оставалось влаги.
Вносят двукратное разведение сывороток, начиная с
диагностического титра 1:500 по 0,05 мл (50 мкл). Желательно
работать с параллелями, внося одно разведение не менее чем в две
лунки.
Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат (+37°С) на 1
час. В течение этого времени происходит образование иммунного
комплекса антиген-антитело.
Содержимое лунок встряхивают и промывают, как указано в п. 5.3.
Вносят антивидовой конъюгат (антитела диагностические против
иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой) в рабочем
разведении или в раститровке в лунки планшета по 0,05 мл (50 мкл).
Конъюгат разводят в буфере инкубации, содержащем 0,1% твин-20 и 1%
бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения
неспецифической сорбции конъюгата на иммунный комплекс
антиген-антитело.
Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат (+37°С) на 30
минут. При этом происходит специфическое присоединение трех
молекул антивидового конъюгата к Fc фрагменту антитела в иммунном
комплексе антиген-антитело.
Содержимое лунок встряхивают, промывают 3-4 раза
дистиллированной водой, заливая лунки до верха и сразу встряхивая
без инкубации, а затем провести процедуру промывки как в п.5.3.
желательно по 3-4 раза по 5 минут.
Во все лунки тщательно высушенного планшета вносят
субстрат-индикаторный раствор по 0,05 (50 мкл).
Планшет оставляют в темноте при комнатной температуре в
течение 20-30 минут. За это время происходит окисление ОФД
перекисью водорода, катализируемое ферментом (пероксидазой), и
окраска содержимого лунок меняется от бесцветного до
желтовато-коричневой, темно-коричневой различной интенсивности (в
зависимости от концентрации фермента в присоединившемся конъюгате
к комплексу антиген-антитело).
Реакцию останавливают внесением 0,05 мл (50 мкл) 1Н серной
кислоты. Оценивать реакцию можно как визуально, так и
инструментально на фотометре при длине волны 492 нм.
Контроли.
"Негативный" контроль - сыворотка людей, содержащая
неспецифические антитела, (заведомо отрицательная), в
диагностическом титре 1:500.
"Позитивный" контроль - сыворотка людей, содержащая
специфические антитела (заведомо положительная), в раститровке
начиная с диагностического титра 1:500.
Контроль субстрата - субстрат-индикаторный раствор без
антигена, сыворотки и антивидового конъюгата.
На каждый из контролей отводят две лунки. Необходимо ставить
все контроли на каждом планшете любого опыта.
Учет результатов реакции.
Реакцию учитывают в том случае, если интенсивность окрашивания
"позитивного" контроля превышает не менее чем вдвое окраску
"негативного" контроля в том же разведении. Также оценивают и
испытуемые сыворотки, сравнивая их окрашивание с окрашиванием
"негативного" контроля в диагностическом титре 1:500. За титр
испытуемой сыворотки принимают последнее наибольшее разведение
сыворотки, превышающее в 2 раза интенсивность "негативного"
контроля. Обычно положительная проба имеет на глаз
желто-коричневую окраску различной интенсивности в отличие от
бесцветной или слегка желтоватой "негативного" контроля. Реакцию
можно оценивать как визуально, так и инструментально на фотометре
при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической
плотности (ОП), за положительный результат принимают то разведение
нетитруемой сыворотки, которое дает превышение оптической
плотности "негативного" контроля в диагностическом титре 1:500 в 2
и более раз.
Для сывороток больных с диагнозом "болезнь Брилла" обычно
характерны титры 1:64000-1:256000, тогда как титры людей,
выявленных ретроспективно - 1:500-1:64000.
Состав буферов и растворов.
1. Буфер адсорбции или присоединения (покрывающий буфер) 0,02М
карбонат-бикарбонатный буфер (КББ) рН 9,5-9,7
Na2Co3 - 1,18 g
NaHCO3 - 3,47 g
Разбавить дистиллированной водой до 1000 мл.
2. 0,02М фосфатно-солевой буфер (ФСБ), рН 7,2-7,4
Na2НРО4х12Н2О - 17,9 g
NaН2РО4х2Н2О - 0,78 g
NaCl - 42,5 g
Разбавить дистиллированной водой до 5000 мл.
3. Буфер инкубации или разведенная, рН7,2-7,4
а) 0,02М ФСБ б) 0,02М ФСБ
твин-20 - 0,01% твин-20 - 0,01% + 1% БСА
4. Буфер отмывки, рН 7,2-7,5
0,02 ФСБ
твин-20 - 0,01%