Эпидемиологическое наблюдение
За очагом сыпного тифа
Эпидемиологическое наблюдение за очагом сыпного тифа включает контроль со стороны центра госсанэпиднадзора за своевременным и полным проведением необходимого объема противоэпидемических мероприятий всеми задействованными медицинскими учреждениями, структурными подразделениями центрагоссанэпиднадзора, дезинфекционными учреждениями и заинтересованными ведомствами.
Завершение противоэпидемических мероприятий
В очаге сыпного тифа
10.1. Работа в очаге эпидемического сыпного тифа или болезни Брилла считается завершенной после окончания срока медицинского наблюдения за контактными, получения результатов лабораторных исследований, уточненных диагнозов, выявления источника инфекции, после полной ликвидации педикулеза в очаге.
10.2. Все данные о результатах эпидемиологического обследования очага заболевания эпидемическим сыпным тифом (болезнью Брилла) и проводимых противоэпидемических мероприятиях с заключением о путях, факторах и источнике инфекции вносятся в карту эпидемиологического обследования очага (ф.357/у). Копия карты по окончании эпидобследования и наблюдения за очагом направляется в отдел особо опасных инфекций центра госсанэпиднадзора в субъекте Российской Федерации. Копия эпидкарты вместе с копией истории болезни, выпиской из амбулаторной карты больного сыпным тифом направляется в Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России.
Руководитель
Департамента Госсанэпиднадзора
А.А.Монисов
Заместитель руководителя
Департамента организации
медицинской помощи населению
А.А. Карпеев
Приложение N 2
к приказу Министерства
здравоохранения
Российской Федерации
от 26 ноября 1998 г. N 342
КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО
СЫПНОГО ТИФА И БОЛЕЗНИ БРИЛЛА (БРИЛЛА-ЦИНССЕРА)
(МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ)
Сыпной тиф - острая трансмиссивная инфекционная болезнь, вызываемая риккетсиями Провачека, передаваемая вшами и характеризующаяся циклическим течением с лихорадкой, интоксикацией, тифозным состоянием, специфическими кожными высыпаниями, поражением центральной нервной системы и сосудистого аппарата. Различают и регистрируют две формы сыпного тифа - эпидемический (вшивый) сыпной тиф и рецидивный сыпной тиф (болезнь Брилла).
Естественная восприимчивость людей к сыпному тифу высокая. Все, не болевшие этой инфекцией в прошлом, независимо от возраста и пола, заболевают клинически выраженным сыпным тифом при наличии условий, обеспечивающих заражение.
Постинфекционный иммунитет стойкий и длительный, однако могут отмечаться рецидивы, связанные с возможностью многолетнего пребывания возбудителя в организме человека и внезапной активизацией инфекционного процесса, проявляющегося болезнью Брилла.
МЕХАНИЗМ ЗАРАЖЕНИЯ. В местах укуса, в результате действия фермента, находящегося в слюне вши, возникает зуд кожи. Заражение человека происходит при втирании экскрементов вшей с содержащимися в них риккетсиями в ранку укуса или расчесы. При самом укусе вшами заражение не происходит, так как в слюнных железах вшей возбудитель сыпного тифа отсутствует. В казуистических случаях возможно также заражение воздушно - пылевым путем, при вдыхании высохших фекалий вшей и при попадании их на конъюнктиву глаз.
ПАТОГЕНЕЗ. Попав в организм человека, риккетсии Провачека проникают в эндотелиальные клетки кровеносных сосудов, в которых они размножаются и гибнут, выделяя токсин. Под действием токсина клетки эндотелия набухают, происходит их разрушение и десквамация. Из разрушенных клеток риккетсии вновь поступают в кровь, часть из них гибнет, высвобождая токсин, остальные вновь проникают в клетки эндотелия кровеносных сосудов. Подобный процесс, без видимых клинических проявлений, продолжается до тех пор, пока не наступит достаточное количественное насыщение организма риккетсиями и их токсином, а вследствие этого - и соответствующие качественные функциональные и органические изменения в сосудах, органах и тканях. Этот процесс соответствует инкубационному периоду и первым 1-2 дням лихорадочного периода.
Высвобождающийся токсин риккетсий оказывает вазодилатационный эффект, особенно в системе мелких сосудов - капилляров, прекапилляров, артериол, венул, в которых нарушается микроциркуляция вплоть до образования паралитической гиперемии и замедления тока крови. В результате этого создаются условия, способствующие развитию гиалиновых тромбов в местах паразитирования риккетсий, где произошла деструкция эндотелия сосудов, с последующим образованием в органах и тканях специфической сыпнотифозной гранулемы, представляющей собой микроскопически выявляемые скопления вокруг участка повреждения сосудов полиморфно - ядерных клеточных элементов и макрофагов, именуемых в литературе узелками Попова - Давыдовского. Больше всего их образуется в головном мозге, коже, надпочечниках, миокарде. Все это приводит к резкому нарушению функционального состояния нервной системы ("сыпнотифозный менингоэнцефалит"), нарушению кровообращения. Риккетсии могут обнаруживаться в органах и тканях с последних дней инкубационного периода и до 3-6 дня нормализации температуры. У некоторых лиц риккетсии могут сохраняться и после выздоровления, вызывая через много лет рецидив сыпного тифа (болезнь Брилла).
Обратное развитие морфологических изменений начинается с 18-20 дня от начала болезни и завершается в основном к концу 4-5 недели, а иногда и позже.
Инфекционный процесс при сыпном тифе сопровождается развитием стойкого и длительного иммунитета. Возникает он вскоре после заражения, в течение лихорадочного периода является "нестерильным", т.е. развивается в присутствии микроба. Многие исследователи у нас и за рубежом и в последующем рассматривают иммунитет как нестерильный, вследствие возможного длительного персистирования риккетсий Провачека в организме перенесших сыпной тиф.
ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ АНАТОМИЯ. Отмечается отечность мозговых оболочек, набухание вещества мозга и кровоизлияния в вещество его. Наблюдается дряблость миокарда. В надпочечниках выявляется отек коркового слоя и капсулы, кровоизлияния в коре. Селезенка значительно увеличена, ее ткань гиперемирована. Часты пневмонии. В большинстве тканей гистологически обнаруживаются узелки Попова - Давыдовского.
КЛИНИКА. Инкубационный период длится от 5 до 25 дней, чаще 10-14 дней.
В течение болезни можно выделить три периода:
1) начальный период - первые 4-5 дней болезни от начала повышения температуры до появления характерной сыпи;
2) период разгара болезни - длится от 4 до 8 дней от момента появления сыпи до окончания лихорадочного состояния;
3) период выздоровления - от начала падения температуры и длится до полного исчезновения всех клинических проявлений болезни.
НАЧАЛЬНЫЙ ПЕРИОД. Продромальные явления отсутствуют, иногда в конце инкубации отмечаются небольшая головная боль, ломота в теле, познабливание.
Заболевание обычно начинается остро с повышения температуры до высоких цифр, появления чувства жара, слабости, иногда легкого познабливания и возможной потливости, головокружения, головной боли, ломоты во всем теле, жажды и потери аппетита. Все эти явления прогрессивно нарастают, особенно головная боль, которая с первых дней становится мучительной. Температура тела повышается ко 2-3 дню болезни и устанавливается в пределах 38,5-40,5 град. С и даже выше (иногда она достигает максимальной величины к концу первых суток).
В дальнейшем лихорадка имеет постоянный характер, реже - ремитирующий (с небольшим понижением на 4-й, 8-й и 12-й день болезни). Отмечаются бессонница, боль в мышцах, суставах рук и ног, обостренность восприятия, раздражительность и беспокойство, переходящие в состояние эйфории и возбуждения, вследствие чего первые 1-2 дня больные могут оставаться на ногах. Иногда вместо эйфории наблюдается состояние заторможенности. Может быть повторная рвота.
Объективно выявляются выраженная гиперемия лица, конъюнктив (склерит, "кроличьи глаза", "красные глаза на красном лице"), кожи шеи и верхней части туловища, легкая амимия, одутловатость лица, умеренный цианоз губ. Кожа на ощупь горячая, повышенной влажности, положителен симптом щипка. Возможны герпетические высыпания на губах и коже носа. Язык суховат и обложен белым налетом. Эти явления прогрессируют в течение первых 2-3 дней.
С 3 дня заболевания можно наблюдать симптом Киари-Авцына, т.е. конъюнктивальную сыпь, располагающуюся на переходных складках конъюнктив в виде единичных петехий, а также энантему на мягком небе (симптом Розенберга), которая предшествует появлению экзантемы. Отмечаются умеренная тахикардия и приглушенность тонов сердца, гипотония, умеренная одышка. Наблюдается тремор языка (симптом Говорова-Годелье). Иногда у больных отмечается слабо выраженный общий дрожательный синдром. Перкуторно определяется увеличение печени и селезенки. С первых дней может наблюдаться инициальный бред, который чаще проявляется в разгар болезни.
ПЕРИОД РАЗГАРА БОЛЕЗНИ. Разгар болезни наступает на 4-5 день заболевания с появления обильной розеолезно-петехиальной сыпи. Первые элементы сыпи появляются за ушами, боковых поверхностях шеи с последующим распространением на кожу боковых поверхностей туловища, груди, живота, сгибательных поверхностей рук и внутренних поверхностей бедер. Размеры элементов обычно не более 3 мм. Различают первичные петехии - на неизмененной коже и вторичные - в центре розеол. Иногда сыпь можно обнаружить на ладонной поверхности и почти никогда не бывает сыпи на лице. Розеолы и петехии располагаются внутрикожно, поэтому они кажутся плоскими и расплывчатыми, с неровными краями, элементы сыпи не сливаются. Точечные петехии можно обнаружить с помощью феномена жгута даже с 3 дня болезни. Элементы сыпи в течение 3-5 дней имеют розовую, ярко-красную или несколько цианотичную окраску, после чего розеолы бледнеют, а петехии становятся пигментированными. Через 7-9 дней от начала высыпания сыпь исчезает, оставляя на короткое время нечеткую пигментацию. Новых высыпаний, как правило, не бывает, в тяжелых случаях может быть подсыпание геморрагической сыпи, что является плохим прогностическим признаком.
В редких случаях сыпь может быть только розеолезной или розеолезно-папулезной или полностью отсутствовать. Более выраженными становятся симптом щипка, пятна Киари-Авцына и энантема, а также нарушения со стороны сосудистого аппарата и центральной нервной системы.
Значительно усиливаются головная боль и бессонница, нарастают слабость, тифозный статус. Возможен инфекционный делирий с галлюцинациями и бредом. Характерны возбужденность больного, беспокойство, суетливость. Иногда больные ведут себя агрессивно, вскакивают с кровати, пытаются бежать. Инфекционные психозы и бред иногда приобретают систематизированный характер, часто отражающий профессиональную деятельность или бытовые отрицательные ситуации (бред ревности). Могут наблюдаться умеренные менингеальные симптомы, при незначительном плеоцитозе и слабо выраженных регидности мышц затылка, симптомах Кернига и Брудзинского. Наблюдается более четкая симптоматика поражения некоторых черепно-мозговых нервов - легкая сглаженность одной из носогубных складок; типичны одутловатость лица и дрожание языка, иногда девиация (отклонение его в сторону), больной показывает язык толчками "симптом спотыкания языка о зубы", отмечается гиперестезия кожи.
Почти у всех больных в большей или меньшей степени выражен общий тремор, могут наблюдаться снижение слуха, полиневриты.
Нарастает нарушение кровообращения. Пульс частый, слабого наполнения и напряжения, иногда нитевидный, аритмичный. Артериальное давление падает, особенно резко уменьшается диастолическое давление. Границы сердца расширены, тоны сердца становятся глухими, выслушивается систолический шум на верхушке. На ЭКГ выявляются признаки диффузного миокардита: уменьшение общего вольтажа зубцов, удлинение интервала PQ, расширение и зазубренность комплекса QRS, уплощенный или отрицательный зубец Т, предсердные или желудочковые экстрасистолы, высокий систолический показатель. В это время может развиться коллапс: больной в прострации, кожа покрыта холодным потом, губы синюшны, дыхание частое, поверхностное, пульс частый и нитевидный, диастолическое артериальное давление низкое или не определяется, тоны сердца не прослушиваются.
Со стороны органов дыхания почти всегда регистрируется одышка. На высоте болезни выявляются трахеобронхит и очаговая пневмония. Аппетит значительно снижен или совершенно отсутствует, сильно беспокоит жажда. Язык сухой, неотечен, обложен густым серо-грязным налетом, может принимать бурую окраску, нередко появляются глубокие трещины. Живот обычной формы, печень и селезенка увеличены у большинства больных, отмечаются задержка стула, метеоризм. Диурез уменьшен, но увеличивается в основном одновременно с "температурными кризами", у некоторых больных отмечается парадоксальная ишурия, когда мочеиспускание происходит каплями при переполненном мочевом пузыре, у тяжело больных возможно непроизвольное мочеиспускание. В моче обнаруживают белок, единичные зернистые и гиалиновые цилиндры, эритроциты и лейкоциты (в небольшом количестве).
В начальном периоде болезни, с 3-5 дня, и в период разгара болезни характерны тромбоцитопения, умеренный лейкоцитоз или тенденция к нему, нейтрофильная реакция, часто с некоторым палочкоядерным сдвигом, эозинопения, лимфопения, ускорение СОЭ. Период разгара болезни длится 8-12 дней в нелеченных случаях. В период реконвалесценции кровь нормализуется, проходя стадию постинфекционного лимфоцитоза.
ПЕРИОД ВЫЗДОРОВЛЕНИЯ. Первыми признаками выздоровления являются снижение температуры ускоренным лизисом или кризисом, которая нормализуется в течение 2-3 суток, что сопровождается уменьшением интоксикации и соответственно тифозного статуса (просветление сознания) и признаков делирия. Симптомами - предвестниками снижения лихорадки являются побледнение или угасание розеолезных элементов сыпи.
К 3-5 дню нормальной температуры нормализуются частота пульса и дыхания, сокращаются до нормы размеры печени и селезенки, восстанавливается нормальное артериальное давление.
Однако несмотря на улучшение общего состояния у больных отмечается умеренная адинамия и слабость, сохраняется гиперестезия кожи. Эти явления держатся 7-8 дней.
В период выздоровления может наблюдаться психическая астения с проявлениями нервозности, капризности, плаксивости, легкой возбудимости. Память и логика долго остаются сниженными, ассоциации поверхностны, речь часто медленная, слова подбираются с трудом.
На 12 день нормальной температуры, при отсутствии осложнений, больные могут быть выписаны. Полное выздоровление наступает примерно через месяц после нормализации температуры. Мышечная слабость сохраняется 2-3 месяца.
КЛИНИЧЕСКИЕ ФОРМЫ СЫПНОГО ТИФА. Болезнь может протекать в легкой (у 10-20% больных), наиболее типичной среднетяжелой (у 60-65% больных), тяжелой (у 10-15% больных) и очень тяжелой формах (молниеносный тиф).
При легкой форме температура обычно не превышает 38,5 град. С, явления интоксикации незначительны, тифозное состояние всегда отсутствует, сознание не изменено или больные несколько заторможены, головная боль и бессонница умеренны. Преобладает розеолезная сыпь, с незначительным количеством петехий. Печень и селезенка увеличены примерно у трети больных. Лихорадка длится до 9 дней и лишь иногда 10-12 дней. Больные всегда выздоравливают. Легкое течение свойственно лицам молодого возраста и особенно детям.
Среднетяжелая форма наиболее типична с точки зрения выраженности симптомов и встречается у большинства больных. Явления интоксикации ярко выражены. Повышение температуры доходит до 39,5 град. С. Часто регистрируются тифозный статус, галлюцинации и бред. Печень и селезенка увеличены. Лихорадочный период длится в среднем 12-14 дней.
Тяжелая форма характеризуется более интенсивным развитием симптомов, особенно сосудистых и мозговых, вследствие значительной интоксикации. Пульс частый - до 140 ударов в 1 мин. (опережает температуру). Артериальное давление падает до 70-80 мм рт. ст. Тоны сердца глухие, наблюдается акроцианоз, тахипное, возможны патологические ритмы дыхания. Кроме рано появляющихся резкого возбуждения, сыпнотифозного делирия, которые быстро сменяются тормозной реакцией, можно отметить менингеальный синдром вплоть до появления судорог, нарушения глотания, дизартрию и т.д. Температура тела достигает 40-41,5 град. С. Сыпь преимущественно петехиальная, с возможными истинными геморрагиями, что является угрожающим признаком. Возможно кровоизлияние в надпочечники с развитием инфекционно-токсического шока.
При очень тяжелой форме (молниеносный тиф) вследствие тяжелой интоксикации и изменений в надпочечниках больные погибают с явлениями инфекционно-токсического шока. Тяжелое и очень тяжелое течение чаще отмечается у пожилых людей.
Иногда встречаются атипичные формы болезни, когда те или иные симптомы отсутствуют или проявляются в нехарактерном для сыпного тифа виде. Подобные формы могут быть следствием раннего применения антибиотиков.
РЕЦИДИВНЫЙ СЫПНОЙ ТИФ ИЛИ БОЛЕЗНЬ БРИЛЛА (БРИЛЛА-ЦИНССЕРА) - острая циклическая инфекционная болезнь, проявляющаяся через многие годы у лиц, переболевших эпидемическим сыпным тифом, характеризующаяся более легким течением и типичным клиническим симптомокомплексом.
Рецидивная природа этого заболевания доказана выделением риккетсий из лимфатической ткани умерших, в анамнезе которых был ранее перенесенный эпидемический сыпной тиф.
Патогенез и клиническая картина при болезни Брилла те же, что и при эпидемическом сыпном тифе, но относительно менее выражена риккетсиозная интоксикация.
Как и эпидемический сыпной тиф, болезнь Брилла начинается остро с появления чувства жара, иногда с легким познабливанием, слабости, головной боли, бессонницы, потери аппетита. Эти явления нарастают в течение 2-3-х дней, когда больные остаются еще на ногах. Головная боль с первых дней становится почти всегда очень сильной и мучительной. Характерна стойкая бессонница.
Температура достигает максимума к 4-5 дню болезни (39-40,5 град. С).
Средняя длительность лихорадочного периода 8-10 дней. С первых дней болезни обычно появляются гиперемия и одутловатость лица, гиперемия шеи и верхней трети туловища, умеренный цианоз губ, положительный симптом щипка, симптом Киари-Авцына, энантема на слегка гиперемированной слизистой мягкого неба.
У большинства больных отмечается обильная типичная розеолезно-петехиальная сыпь, розеолы могут быть более крупными, чем при сыпном тифе, наблюдаются и розеолезно-папулезные элементы; петехиальные элементы могут быть скудными и даже отсутствовать. Сыпь сохраняется в течение 3-7 дней.
Наблюдаются одышка, но чаще дыхание соответствует температуре. Нередко отмечается тахикардия и гипотония. Тоны сердца приглушены, иногда значительно, может выслушиваться систолический шум. Выявляются явления миокардита. Аппетит снижен или отсутствует, язык обложен. Печень и селезенка умеренно увеличены. Часто наблюдается олигурия, изредка - парадоксальная ишурия. Отмечается незначительная альбуминурия.
Серьезные психические нарушения наблюдаются редко, но могут быть эйфория и возбужденность больных или заторможенность, умеренный делирий, иногда деперсонализация, двигательное возбуждение в той или иной степени отмечаются часто. Возможен общий тремор (дрожание губ и конечностей, особенно пальцев рук, незначительная дизартрия), легкая сглаженность носогубных складок, девиация языка, симптом Говорова-Годелье, симптомы менингизма. Один или несколько этих симптомов, чаще симптом Говорова-Годелье и гиперестезия кожи, появляются уже на 3-4 день болезни. Нередко отмечается неврит слухового нерва. Тяжелое течение встречается только у пожилых лиц.
Изменения со стороны сердечно-сосудистой системы исчезают к 5-7 дню нормальной температуры.
Реконвалесценция протекает легче и короче, чем при эпидемическом сыпном тифе. Сердечно-сосудистая деятельность восстанавливается к 5-7 дню нормальной температуры и лишь у некоторых больных в более поздние сроки наблюдается постинфекционный миокардит. Восстановление функций центральной нервной системы наступает к 15-17 дню нормальной температуры. Размеры печени и селезенки нормализуются к 3-4 дню периода реконвалесценции (нормализации температуры).
При бесконтрольном, сверхраннем начале антибиотикотерапии (1-2 дни болезни) возможны ранние рецидивы сыпного тифа.
В условиях завшивленности больные болезнью Брилла могут явиться источником заболеваний эпидемическим сыпным тифом.
ОСЛОЖНЕНИЯ возникают при позднем начале лечения и плохом уходе за больным. Возможно развитие коллапса, тромбозов, тромбоэмболий, разрывов мозговых сосудов, с явлениями парезов и даже параличей, кишечных кровотечений, миокардита, инфаркта, психозов периода реконвалесценции и более поздних, полирадикулоневритов, поражений ядер черепно-мозговых нервов, а также вторичных пневмоний, отитов и паротитов, абсцессов, фурункулеза, пиелита, пиелоцистита. Применение антибиотиков резко снижает возможность осложнений.
ДИАГНОСТИКА СЫПНОГО ТИФА. В начальном периоде болезни, вплоть до 6-7 дня, сыпной тиф может быть диагностирован только клинически.
Лабораторное подтверждение диагноза осуществляется с помощью высокочувствительных серологических реакций (РСК и РНГА с риккетсиями Провачека), которые становятся положительными не ранее 8-10 дня болезни. Реакция связывания комплемента (РСК) является одной из наиболее употребительных для распознавания как клинически выраженных случаев, так и стертых форм сыпно-тифозной инфекции. Комплементсвязывающие антитела обнаруживаются с 5-7 дня болезни у 50-60%, а с 10 дня - у 100% больных сыпным тифом. Максимальные титры антител (1:320-1:5120) регистрируются на 2-3 неделе болезни. Диагностическим титром при однократном определении следует считать 1:160. Более достоверным считается определение антител в динамике (через 5-7 дней после предыдущего исследования). Для ретроспективной диагностики сыпного тифа диагностическими титрами являются 1:10-1:20, так как комплементсвязывающие антитела к риккетсиям Провачека сохраняются до 10 лет и более.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) дает возможность диагностировать свежие случаи сыпного тифа, она положительна у большинства больных уже с 3-5 дня болезни. Максимальные титры антител (1:6400-1:12800) регистрируются на 2-3-й неделе болезни. Диагностический титр при однократном определении в РНГА - 1:1000. Более достоверным является определение антител в динамике.
Наиболее проста реакция агглютинации (РА), но применяется она редко, так как менее чувствительна, чем РСК и РНГА: диагностический титр реакции - 1:160. Она высокочувствительна при применении антигена, полученного из риккетсий, выращенных во вшах (реакция Вейгля).
Для обнаружения специфических антител против риккетсий могут быть использованы реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), иммуноферментный метод (ИФА). Для выявления антигенов риккетсий Провачека может применяться полимеразная цепная реакция (ПЦР).
При первичном сыпном тифе выявляются антитела IgM класса, а при болезни Брилла - IgG класса. Для дифференцировки антител IgM и IgG классов применяют цистеиновую пробу или пробу с 2-меркаптоэтанолом.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ДИАГНОЗ. В начальном периоде сыпной тиф необходимо дифференцировать с гриппом, очаговой пневмонией, менингитами, геморрагическими лихорадками, а в разгар болезни - с брюшным тифом и паратифами, клещевым сыпным тифом, лекарственной болезнью, трихинеллезом, различными эритемами, орнитозом и т.д.
Несмотря на наличие сходных жалоб и некоторых объективных данных (гиперемия лица, шеи и конъюнктив, тахикардия), ГРИПП отличается более острым началом (больной называет не только день, но и час начала болезни), резкой слабостью, развивающейся в первый же день болезни, наличием постоянной обильной потливости, отсутствием одутловатости лица и амимии его, а также симптома Говорова-Годелье. При гриппе не бывает сыпи и увеличения селезенки. Головная боль локализуется обычно в области лба, надбровных дуг и височных областях, характерна боль при надавливании на глазные яблоки и при движении ими. При сыпном тифе отсутствует катаральный синдром (ринит, трахеит, бронхит).
Дифференциация сыпного тифа с ОЧАГОВЫМИ ПНЕВМОНИЯМИ осуществляется с учетом характеристики дыхания, физикальных данных, расхождения крыльев носа при дыхании, кашля, умеренной потливости, возможного болевого синдрома в области груди, отсутствия сыпи, симптома Киари-Авцына, симптомов поражения центральной нервной системы и рентгенологических данных.
МЕНИНГИТЫ дифференцируются от сыпного тифа по наличию выраженного менингеального синдрома (регидность мышц затылка, положительные симптомы Кернига и Брудзинского). Решающим в диагностике является анализ спинномозговой жидкости.
При ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЛИХОРАДКАХ, особенно с почечным синдромом, более выражена гиперемия лица и конъюнктив, сыпь носит характер необильных точечных геморрагий, чаще выявляемых на боковых поверхностях туловища и подмышечных областях. Характерны рвота, икота, боли в пояснице и животе, типичны жажда и олигурия. Наблюдаются эритроцитоз, нормальная или ускоренная СОЭ, повышение остаточного азота крови, гематурия, альбуминурия, цилиндроурия.
При БРЮШНОМ ТИФЕ характерны бледность кожных покровов лица, общая адинамия и вялость. Язык уплощен, обложен, с отпечатками зубов по краям и на кончике. Часто отмечается брадикардия с дискротией пульса. Обычен метеоризм и урчание в правой подвздошной области, более позднее увеличение печени и селезенки. Сыпь скудная розеолезная, появляется не ранее 8 дня болезни на груди, животе и боковых поверхностях туловища, с последующими подсыпаниями. В крови лейкопения с эозинопенией, палочкоядерный сдвиг с относительным лимфоцитозом, тромбоцитопения.
Дифференциация сыпного тифа и КЛЕЩЕВОГО СЫПНОГО ТИФА, встречающегося в районах Сибири и Дальнего Востока, основывается на характерных симптомах: наличие у большинства больных первичного аффекта на месте укуса клеща, представляющего собой плотный инфильтрат коричневого или бурого цвета до 1,5 см в диаметре с возможным некрозом в центре, регионарного лимфаденита, развивающегося почти одновременно с первичным аффектом. Розеолезно-папулезная сыпь при этом заболевании яркая, распространена по всему телу, появляется рано - на 2-4 дни болезни.
Аллергическая форма ЛЕКАРСТВЕННОЙ БОЛЕЗНИ, возникающей при лечении сульфаниламидами и антибиотиками различных заболеваний, сопровождающихся острыми лихорадками (грипп, пневмония и т.д.), нередко смешивается с сыпным тифом, особенно при появлении сыпи на 4-5 день болезни. Однако элементы сыпи при этом чаще экссудативного характера, иногда розеолезно-папулезные, выступают над поверхностью кожи, весьма обильны на всех участках тела, но больше на разгибательной поверхности суставов, имеют тенденцию к слиянию. Отмечается лимфаденопатия, селезенка обычно не увеличивается.
В клинической картине ТРИХИНЕЛЛЕЗА характерны отек лица и век, головная боль и боль во всех группах мышц при движении и пальпации, умеренный конъюнктивит, болезненность при движении глаз. Сыпь обильная, может быть розеолезно-папулезной, уртикальной и даже петехиальной. Возможны подсыпания. Типична гиперэозинофилия. В анамнезе - указание на употребление в пищу сырой свинины и групповая заболеваемость.
Различные ЭРИТЕМЫ - экссудативная и многоформная - отличаются от сыпного тифа тем, что сыпь при них покрывает все тело, в том числе и лицо. Эритематозно-экссудативные элементы обычно крупных размеров и часто сливаются между собой. Увеличиваются периферические лимфатические узлы и селезенка. Выражены потливость и озноб. Типичны боли в суставах. Для многоформной эритемы характерна симметричность расположения сыпи. После отцветания ее отмечается шелушение.
ЛЕЧЕНИЕ. Заболевшие сыпным тифом подлежат обязательной госпитализации. Лечение больных должно быть комплексным - этиотропным, патогенетическим и симптоматическим при условии правильного ухода.
Этиотропное лечение осуществляется с помощью препаратов тетрациклинового ряда (тетрациклин, окситетрациклин, доксициклин) и левомицетина. Тетрациклиновые препараты назначают по 0,3-0,4 г, а левомицетин - 0,5 г 4 раза в сутки для взрослых (детям лекарства назначают соответственно возрасту). Показано, что однократный прием 100 мг доксициклина обеспечивал обрывание течения сыпного тифа.
Больным, у которых оральный прием препарата затруднен, проводят парентеральное введение тех же препаратов в указанных дозах и схемах. При тяжелом и очень тяжелом течении болезни тетрациклины можно вводить внутримышечно или внутривенно по 250 мг 2 раза в сутки.
При лечении антибиотиками температура нормализуется через 1,5-2 суток и поэтому обычно с 3 дня нормальной температуры их отменяют, и лишь при появлении вторичных осложнений лечение может затягиваться на несколько дней. Длительность курса лечения обычно 4-5 дней.
Патогенетическая терапия включает внутривенное введение дезинтоксикационных растворов (5% раствор глюкозы или изотонический раствор хлорида натрия по 500-600 мл). Применяют оксигенотерапию (кислород вводят с помощью носовых катетеров или маски). При нарушении кровообращения вводят сердечные и сосудистые средства (камфора, кордиамин, норадреналин, эфедрин, мезатон, а также коргликон и строфантин), которые назначают по показаниям. В случае выраженного возбуждения больных и делирия применяют бромиды, хлоралгидрат, аминазин, барбитураты, седуксен и другие транквилизаторы. Успокаивающее влияние оказывает обтирание теплой водой (37-38,5 град. С). При тяжелом и очень тяжелом течении болезни проводится интенсивная терапия с использованием антибиотиков, при инфекционно-токсическом шоке показаны гормоны (преднизолон, дексаметазон) короткими курсами.
При делирии назначают бромиды, барбитураты, аминазин, галоперидол или оксибутират натрия. Показаны анальгетики, сердечные гликозиды, сосудистые аналептики, антикоагулянты.
Важен туалет ротовой полости (профилактика гнойного паротита), уход, гигиена кожи (пролежни).
Постельный режим показан до 5-6 дня нормальной температуры, далее больным разрешается вставать. Выписка должна проводиться не ранее 12 дня нормальной температуры.
Заместитель руководителя
Департамента организации
медицинской помощи населению
А.А.КАРПЕЕВ
Начальник
Управления охраны
здоровья матери и ребенка
Д.И.ЗЕЛИНСКАЯ
Приложение N 3
к приказу
Министерства здравоохранения
Российской Федерации
от 26 ноября 1998 г. N 342
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
ЭПИДЕМИЧЕСКОГО СЫПНОГО ТИФА И
БОЛЕЗНИ БРИЛЛА (БРИЛЛА-ЦИНССЕРА)
(МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ)
1. Введение.
Серологические методы являются обязательным разделом лабораторной диагностики сыпнотифозной инфекции и изучения их эпидемиологии. Серологические реакции выполняются с применением видоспецифических антигенов и вследствие своей высокой специфичности имеют решающее значение для подтверждения риккетсиозной природы заболевания.
Предлагаемые методические рекомендации составлены с целью унификации методик исследований с учетом опыта ряда риккетсиозных лабораторий России и зарубежных стран и в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения.
Методы серологических исследований, приведенные в методических указаниях, обеспечены коммерческими препаратами.
2. Серологические методы диагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилла (Брилла-Цинссера).
2.1. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).
Позволяет выявить антитела к возбудителю сыпного тифа в ранние, начиная с 5-7-го дня болезни, что придает ей особую ценность. В острый период болезни титры в РНГА колеблются от 1600 до 51200. В основе РНГА лежит специфическая агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных риккетсиозным антигеном.
В основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) лежит специфическая агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных риккетсиозным антигеном или иммуноглобулинами, в присутствии соответствующих групповых антител или антигенов.
2.1.1. РНГА с антигенным риккетсиозным эритроцитарным диагностикумом.
РНГА с антигенным риккетсиальным эритроцитарным диагностикумом предназначена для обнаружения и титрования специфических антител риккетсиальной природы в исследуемых сыворотках людей.
Антигенный эритроцитарный диагностикум представляет собой лиофильно высушенную взвесь 3% формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных гидролизованным антигеном (гаптеном) риккетсий.
К антигенному эритроцитарному диагностикуму прилагается лиофильно высушенная 6% взвесь несенсибилизированных (контрольных) формалинизированных эритроцитов барана, предназначенных для контроля исследуемых сывороток и истощения их от неспецифических гемагглютининов, последнее может проводиться и неформалинизированными эритроцитами. Для разведения ингредиентов реакции используют формалинизированный физиологический раствор (ФФР). Последний представляет собой 0,85% раствор хлорида натрия (рН=7.0), к которому добавлен формалин из расчета 0,3 на 100 мл раствора хлорида натрия.
Ингредиенты реакции:
1) Исследуемая сыворотка или исследуемый антиген.
2) Антигенный риккетсиальный или иммуноглобулиновый риккетсиальный эритроцитарный диагностикум или антигены для РНГА.
3) Формалинизированные или негативные эритроциты барана.
4) Физиологический раствор, 1% раствор нормальной кроличьей сыворотки.
5) Формалин.
РНГА можно ставить как макрометодом в стандартных плексигласовых планшетах с лунками, так и микрометодом - в планшетах с лунками типа "U" микротитратора Такачи. При постановке реакции макрометодом эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 1,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 2 мл, а содержимое ампулы с контрольными эритроцитами - в 4 мл ФФР.
При постановке реакции микрометодом антигенный риккетсиальный эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 0,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 6 мл, а с контрольными эритроцитами - в 12 мл ФФР.
Исследуемые сыворотки перед постановкой РНГА инактивируют при +56 град. С в течение 30 минут и истощают эритроцитами барана. С этой целью вскрывают ампулу с контрольными эритроцитами, разводят ее содержимое в 4-12 мл ФФР (в зависимости от постановки макро- и микрометодом), после чего 5 мл полученной 1% взвеси эритроцитов центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. и надосадочную жидкость отсасывают. К осадку добавляют 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, перемешивают, выдерживают 30 минут при +37 град. С и центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. Надосадочную жидкость, представляющую собой истощенную сыворотку, исследуют в РНГА.
Постановка РНГА.
Вначале готовят исходное разведение исследуемой сыворотки (1:25). С этой целью к 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, истощенной эритроцитами барана, добавляют 1,5 мл ФФР.
Для приготовления последовательных разведений исследуемой сыворотки в 10 лунок горизонтального ряда планшета наливают по 0,4 (0,05) мл ФФР. В первую лунку добавляют 0,04 (0,05) мл исходного разведения (1:25) исследуемой сыворотки. После тщательного перемешивания переносят 0,4 (0,05) мл содержимого первой лунки во вторую, из второй переносят в третью 0,4 (0,05) мл и т.д. Из первой лунки 0,4 (0,05) мл смеси выливают. Затем в каждую лунку добавляют предварительно хорошо размешанного эритроцитарного диагностикума по 0,1 (0,025) мл, планшет встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Учет результатов реакции - спустя соответственно 4-5 или 2-3 часа. Постановка опыта должна сопровождаться следующими контролями:
1. Контроль исследуемой сыворотки на отсутствие неспецифических гемагглютининов: в лунку планшета наливают 0,2 (0,025) мл исследуемой сыворотки в исходном разведении 1:25, добавляют 0,2 (0,025) мл ФФР и 0,1 (0,025) мл контрольных эритроцитов.
2. Контроль эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной гемагглютинации: в 2 лунки, содержащие по 0,4 (0,05) мл ФФР, добавляют по 0,1 (0,025) мл эритроцитарного диагностикума.
3. Заведомо положительный контроль: постановка РНГА с тест-сывороткой к риккетсиям Провачека, прилагаемой к данной серии эритроцитарного диагностикума.
Учет результатов РНГА.
Учет результатов реакции проводят по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. Реакцию считают положительной (оценивают на "+"), если агглютинировавшие эритроциты выстилают дно лунки, образуя по форме перевернутый купол с ровным или фасеточным краем. Титром исследуемой сыворотки считают максимальное ее разведение, которое вызывает четкую агглютинацию эритроцитарного диагностикума.
Реакцию считают отрицательной (оценивают на "-") при оседании эритроцитов на дно лунки в виде диска или компактного кольца с четким ровным краем. В сомнительных случаях реакцию оценивают на "+/-".
2.1.2. РНГА с препаратом на основе нативных эритроцитов.
При отсутствии коммерческого антигенного риккетсиального эритроцитарного диагностикума РНГА можно ставить с нативными эритроцитами барана, предварительно сенсибилизированными коммерческим антигеном (гаптеном) риккетсий для реакции гемагглютинации. Антиген растворяют в физиологическом растворе (рН=7,0) в соответствии с указаниями на этикетке ампулы. 4 мл растворенного антигена смешивают с 0,1 мл осадка отмытых эритроцитов барана, выдерживают смесь в течение 1 часа при +37 град. С, встряхивая каждые 15 минут, затем центрифугируют 10 минут при 2500-3000 об/мин., надосадочную жидкость отсасывают, а осадок суспендируют в 10 мл физиологического раствора (рН=7,0), получая 10 мл 1% взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Такой препарат может сохраняться в течение нескольких дней при +4 град. С без снижения активности. РНГА в этом случае ставят на обычном физиологическом растворе (рН=7,0), в остальном подготовка ингредиентов, постановка реакции и учет результатов проводятся точно также, как при использовании сухого антигенного риккетсиального эритроцитарного диагностикума, за исключением первого разведения исследуемой сыворотки, которое берется не 1:25, а 1:250.
2.2. Метод флуоресцирующих антител.
Метод флуоресцирующих антител (МФА) - экспресс-метод - сочетает высокую чувствительность люминесцентного анализа с высокой специфичностью иммунологического метода. МФА применяется в лабораторной диагностике с целью выявления риккетсиальных антигенов и антител. Этот метод используют в прямой и непрямой модификации с применением флуоресцирующих конъюгатов, полученных на основе иммуноглобулинов специфических сывороток.
Ингредиенты и оборудование.
1. Риккетсиальные корпускулярные антигены (для МФА).
2. Специфические антириккетсиальные сыворотки.
3. Люминесцирующие специфические риккетсиальные сыворотки.
4. Люминесцирующие антивидовые сыворотки к иммуноглобулинам человека и различного вида животных.
5. Люминесцирующие Fab-фрагменты риккетсиальных антител.
6. Забуференный физиологический раствор рН = 7,2.
7. Спирт 96 град.
8. Ацетон.
9. Дистиллированная вода.
10. Бычий альбумин, меченый родамином или Эванс.
11. Люминесцентный микроскоп (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Л, ЛЮМАМ).
12. Предметные стекла.
13. Чашки Петри.
14. Емкости для промывания стекол.
15. Фильтровальная бумага.
2.2.1. Прямой метод флуоресцирующих антител.
Прямой метод флуоресцирующих антител (пМФА) используется с целью выявления риккетсиальных антигенов в биологических пробах и объектах внешней среды.
Метод осуществляют следующим образом. На тщательно вымытые и обезжиренные предметные стекла делают тонкие мазки или отпечатки исследуемого материала. После высыхания мазки фиксируют этиловым спиртом или ацетоном в течение 30 минут. По мазку восковым карандашом делают ряд окружностей диаметром 0,5 см, в зависимости от количества искомых антигенов, чтобы создать барьер, препятствующий растеканию люминесцирующей сыворотки.
На эти поля фиксированных и высушенных мазков наносят по капле разведенных флуоресцирующих сывороток против искомых антигенов (рабочее разведение указано на ампуле) в смеси с равным объемом Эванса 0,1% или бычьего альбумина, меченого родамином (в смеси оба раствора должны быть в рабочем разведении). В контрольное поле наносят гетерологичную флуоресцирующую сыворотку так же в смеси с бычьим альбумином. Обработку мазков проводят 30 минут при температуре +37 град. С во влажной камере (чашка Петри с увлажненным дном), что предупреждает высыхание конъюгата. Отмывание мазков от избытка флуоресцирующей сыворотки производят в фосфатном буферном растворе (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут. После ополаскивания дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют в люминесцентном микроскопе.
Учет результатов реакции.
Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, объектив 90х, окуляр 10х или 7х. Первичные светофильтры для МЛ 2-ФС-1-4; СЗС 7-2; БС-8-2, окулярный или запирающий - 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС 21-2, ФС 1-6; окуляр зеленый (т.е. фильтры, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатом и изотиоцианата флуоресцеина).
Просматривают не менее 10-20 полей зрения. Оценку результатов пМФА проводят на основании количества, яркости флуоресцеина и морфологических особенностей риккетсий. Для этого используют условную систему обозначения при помощи крестов:
"+++++" - яркая, сверкающая флуоресценция;
"+++" - отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция с характерным для данного флуорохрома цветов (в данном случае зеленый).
Морфология риккетсий выявляется хорошо, у отдельно лежащих корпускул видны четкие колечки (ободки) за счет более яркого свечения комплекса антител с поверхностным антигеном;
"++" - флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко;
"+" - флуоресценция очень слабая, морфология риккетсий различима плохо, цвет неопределенный;
"-" - флуоресценция отсутствует.
Результат считается положительным при обнаружении в некоторых полях зрения не менее 5 риккетсий с интенсивностью свечения возбудителя не менее, чем на "+++" при четко отрицательном контроле.
2.2.2. Непрямой метод флуоресцирующих антител.
Непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА) или реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) используют с целью выявления специфических антител у больных и переболевших риккетсиозами людей и животных.
Метод используют следующим образом. В ампулу с сухим риккетсиальным корпускулярным антигеном за 2 часа до приготовления препарата добавляют 1 мл дистиллированной воды с целью насыщения корпускул риккетсий влагой. Из этого основного разведения готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обечпечивающей в каждом поле зрения примерно до 100 риккетсиальных клеток. На предметном стекле, хорошо вымытом и обезжиренном, наносят капли антигена в соответствующем рабочем разведении. На каждое стекло наносят 8 капель. Этого количества достаточно для испытания одной сыворотки. Если в вашем распоряжении имеется взвесь антигена, то с ней поступают следующим образом: из основного раствора готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающем в каждом поле зрения около 100 риккетсиальных клеток. На предметное стекло, хорошо вымытое и обезжиренное наносят, по 8 капель антигена, тщательно перемешанного пипетированием в соответствующем рабочем разведении кончиком канцелярского пера или туберкулиновым шприцом со срезанным концом.
Мазки хорошо высушивают на воздухе, фиксируют спиртом или ацетоном (приобретенные антигенные пятна уже зафиксированы) в течение 20 минут и сохраняют до использования при температуре от 0 до +4 град. С, в пределах месяца. Препараты необходимо оберегать от увлажнения.
Из испытуемых сывороток, предварительно прогретых в течение 30 минут при +56 град. С, готовят двукратные разведения в физиологическом растворе (от 1:20 до 1:2560, а при необходимости и выше).
Капли из соответствующих разведений сыворотки наносят на мазки антигена и выдерживают 45 минут во влажной камере при +37 град. С. Затем препарат промывают фосфатным буфером (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут и высушивают на воздухе.
После высушивания на мазки наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма-глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере 30 минут при +37 град. С. В качестве антивидовых препаратов применяют люминесцирующие сыворотки против гамма-глобулина человека и животных в зависимости от видовой принадлежности испытуемых сывороток. На этом этапе выполнения реакции также рекомендуется использование бычьего альбумина, меченого родамином, или 0,1% раствора Эванса для гашения неспецифического свечения, которые смешиваются с антивидовой люминесцирующей сывороткой в равном объеме, с тем, чтобы иметь рабочие дозы указанных ингредиентов. Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 минут и высушивают на воздухе.
В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную сыворотки и контроль люминесцирующей антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно антивидовой люминесцирующей сывороткой.
Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливает свечение риккетсий на "++", при наличии свечения на "+++" или "++++" в предыдущем разведении.
Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки - свечение риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей антивидовой сывороткой в рабочем разведении.
2.3. Реакция связывания комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК) является универсальной, так как дает возможность получения объективных результатов при проведении текущей и ретроспективной диагностики. Комплемент связывающие антитела сохраняются в сыворотке переболевших людей десятки лет. В этой связи РСК незаменима для ретроспективной диагностики.
РСК имеет целью определение в исследуемых сыворотках специфических антител.
Сущность реакции заключается в связывании комплемента комплексом антиген-антитело, что обнаруживается в присутствии индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. При образовании специфического комплекса антиген-антитело последний связывает комплемент, вследствие чего после добавки гемолитической системы не возникает гемолиза бараньих эритроцитов. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов.
Таким образом, положительный результат РСК характеризуется оседанием эритроцитов (задержкой гемолиза), а отрицательный - феноменом гемолиза эритроцитов.
Ниже приведены две схемы постановки РСК, отличающиеся рядом преимуществ в сравнении с ранее применявшимися в нашей стране (Голиневич, 1962):
1) уменьшением объема использованных ингредиентов;
2) упрощением схемы титрования комплемента;
3) получением более достоверных результатов реакции за счет титрования комплемента в присутствии антигенов (риккетсиальные антигены могут поглощать некоторое количество комплемента, что следует принимать во внимание и учитывать при постановке реакции).
Ингредиенты реакции: 1) испытуемая сыворотка, 2) антиген; 3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.
Обязательным условием постановки РСК является использование точно оттитрованных компонентов. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл (1-я схема) или 0,6 мл (2-я схема).
Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо вымытой и высушенной в суховоздушном шкафу.
Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку. Все разведения делают в свежеприготовленном стерильном физиологическом растворе (0,85% раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде).
Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30 минут при 56-58 град. С (для разрушения содержащимися в ней комплемента и ингибиторов).
Риккетсиальные антигены растворяют в указанном на этикетке ампулы количестве физиологического раствора, которое соответствует рабочему разведению, определенному предприятием-изготовителем.
Сухой комплемент разводят согласно прилагаемой к этому препарату инструкции. Гемолитическая сыворотка выпускается в ампулах: это - сыворотка кролика, иммунизированного по определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. На этикетке ампулы гемолитической сыворотки указан ее титр. В реакции используют разведение гемолитической сыворотки в три раза меньше титра, указанного на этикетке: например, титр, указанный на этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку, разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра производят следующим образом. Готовят основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл гемолитической сыворотки +9,9 мл физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно разливают по 0,1 мл разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1:1000 до 1:3600, в каждую пробирку добавляют комплемент в разведении 1:10 в объеме 0,1 мл и по 0,1 мл 3% взвеси бараньих эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,2 мл физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в термостате при +30 град. С в течение 1 часа. По наличию полного гемолиза эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.
Таблица 1
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
| Ингредиенты опыта | Разведение гемолитической сыворотки | |||||||||
| 1:1000 | 1:1200 | 1:1600 | 1:1800 | 1:2000 | 1:2400 | 1:2800 | 1:3000 | 1:3200 | 1:3600 | |
| Гемолитическая сы- воротка (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| 3% взвесь бараньих эритроцитов (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Комплемент в раз- ведении (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Физ. раствор (мл) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Оценка результатов опыта | - | - | - | - | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
Титр гемолитической сыворотки 1:1800.
Для получения эритроцитов барана кровь, взятую из яремной вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми бусами путем встряхивания в течение 10-15 минут, процеживают через стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до +4 град. С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят обычно в течение 1 месяца в консерванте "Консервант крови N 7Б", выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов, или каком-либо другом консерванте.
1-я схема постановки РСК.
Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы. Титрование комплемента ведут в присутствии антигена. Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в 1 мл (таблица 2).
Таблица 2
| Ингредиенты реакции | Дозы комплемента | ||||||||
| Комплемент в разведении 1:10 (мл) | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 |
| Физиологический раствор (мл) | 0,9 | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 0,5 | 0,4 | 0,3 | 0,2 | 0,1 |
Затем ставят опыт титрования комплемента.
Таблица 3
| Ингредиенты реакции | Дозы комплемента | ||||||||
| Комплемент в различных дозах (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Антиген (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Физиологический раствор (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Гемолитическая система (мл) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Оценка результатов | 4+ | 3+ | 2+ | + | - | - | - | - | - |
Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37 град. С на 1 час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную предварительно в термостате в течение 30 минут) и через 30 минут производят учет результатов.
Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++); частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом (+).
Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице комплемента при проведении связывания в термостате при +37 град. С в течение 1 часа.
Постановка основного опыта.
1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К различным разведениям их добавляют по 0,1 м: антигена и комплемента в рабочих дозах.
К каждому опыту ставят следующие контроли:
1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в исходном разведении + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);
2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора, 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);
3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора);
4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора);
5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют до ее титра;
6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют в 2-х-3-х разведениях (1:10 - 1:40), включая так, же как и для п. 5 контроль сывороток в исходных разведениях.
После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат при +37 град. С на 1 час.
2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят пробирки в термостат на 20-30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях.
2-я схема постановки РСК (по Fiset).
Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции - 0,6 мл, упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при температуре +4 град. С 16-18 часов не в день постановки реакции, 1-2 раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских свинок и хранящегося при температуре не выше +/-20 град. С (однако размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).
Титрование комплемента.
Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия сухого комплемента содержимое ампулы растворяют в 10 мл физиологического раствора), из которого по схеме получают последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).
Таблица 4
| Ингредиенты | Разведения комплемента | |||||
| 1:15 | 1:18 | 1:20 | 1:25 | 1:30 | и т.д. | |
| Комплемент 1:10 (мл) | 0,5 | 0,5 | 0,5 | |||
| Физиологический раствор (мл) | 0,5 | 0,8 | 0,5 | 0,75 | 1,0 |
Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу использованных в РСК антигенов) (таблица 5).
Таблица 5
| Ингредиенты реакции | Разведение комплемента | ||||||
| Контрольный ряд (оценка качества комплемента) | |||||||
| 1:10 | 1:15 | 1:18 | 1:20 | 1:25 | 1:30 | и т.д. | |
| Комплемент в различных разведениях (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | |
| Физиологический раствор (мл) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | |
| Гемолитическая система (мл) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | |
| Оценка результата | - | - | - | - | - | + | |
| Опытный ряд (оценка антикомплементарных свойств антигена) | |||||||
| Комплемент в различных разведениях (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | |
| Антиген в рабочей дозе (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | |
| Физиологический раствор (мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | |
| Гемолитическая система <*> (мл) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | |
| Оценка результата | - | - | - | - | + | +++ |
--------------------------------
<*> Добавляют на второй день титрования комплемента (после 16-18 часов экспозиции при температуре + 4 град. С).
Дозу комплемента с антигеном, дающую полный гемолиз, считают за титр комплемента или "полную единицу", в данном примере она соответствует разведению комплемента 1:20. Раз оттитрованной рабочей дозой комплемента можно пользоваться в течение месяца при работе с этой серией комплемента и эритроцитов.
После 30-минутной экспозиции при температуре +37 град. С учитывают результаты.
При постановке реакции "холодным методом" (0 град. С) рабочая доза комплемента соответствует двум полным единицам в виде удвоенного объема комплемента - 0,2 мл. Например, полный гемолиз в опытном ряду, т.е. в присутствии антигена, отмечен в пробирке при разведении комплемента 1:20, а в контрольном ряду - 1:25. В итоге рабочая доза комплемента при использовании в реакции данного антигена соответствует разведению 1:20 в объеме 0,2 мл, поскольку в этих условиях не выявляются антикомплементарные свойства антигена. Например, на 100 пробирок необходимо приготовить 20 мл разведенного 1:20 комплемента (из расчета 0,2 мл на пробирку), следовательно, нужно взять 1,0 мл цельного комплемента и 19,0 мл физиологического раствора.
В случае, если в реакции используют не 1, а 2 или 3 разного вида антигенов, то и титрование комплемента проводят в присутствии всех видов антигенов, после чего выбирают соответствующие дозы комплемента.
При постановке реакции при +37 град. С рабочая доза комплемента составит 1 полную единицу, т.е. объем его не 0,2, а 0,1 мл и общий объем РСК в этом случае будет 0,5 мл.
В основном опыте контролируют рабочую дозу комплемента, полную единицу комплемента и ее половину ("холодное" связывание) или полную единицу комплемента и ее половину (связывание при +37 град. С). Иными словами, в первом случае: 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора; 0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,3 мл физиологического раствора, и 0,05 мл комплемента в рабочей дозе + 0,35 мл физиологического раствора. В 1 и 2-ом контролях должен наблюдаться полный гемолиз, в 3-ем - задержка его на три - два креста. Во 2-м случае (т.е. связывание при +37 град. С) для контроля используют