Кинетика реакций, катализируемых ферментами
Биохимические реакции в биологических системах редко протекают в отсутствие катализатора. Роль таких катализаторов выполняют специфические белки, называемые ферментами. Ферменты обладают высокой специфичностью как в отношении катализируемой ими реакции, так и в отношении субстратов, т.е. участвующих в реакции веществ. Превращение вещества каким-либо ферментом предшествует формирование фермент-субстратного комплекса (ES). При высоких концентрациях субстрата весь фермент будет в комплексе с субстратом и скорость реакции будет максимальной.
На рисунке 1. показана зависимость скорости ферментативного катализа v от концентрации субстрата [S]. При постоянной концентрации фермента и малых значениях [S] скорость прямо пропорциональна [S], реакция протекает в соответствии с уравнением первого порядка. При высоких значениях [S] скорость почти не зависит от [S], реакция протекает в соответствии с уравнением нулевого порядка.
Рис. 1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.
Л.Анри первым предложил модель, объясняющую такую кинетику.
Обозначим фермент – Е, а субстрат – S. Ферментативная реакция будет идти в две стадии:
k1
E + S ↔ ES (быстрая стадия)
k--1
k2
ES → продукты + Е (медленная стадия)
Как видно из этих уравнений, фермент Е взаимодействует с субстратом S с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Константа скорости прямой реакции – k+1, а константа обратной – k-1. Затем фермент-субстратный комплекс распадается с образованием продукта реакции, а катализатор остается в первоначальном состоянии. Константа скорости распада комплекса ES с образованием продукта – k+2. Поскольку комплекс ES способен диссоциировать, можно записать выражение равновесной константы диссоциации комплекса, KS, которая равна отношению констант скоростей обратной и прямой реакций:
k -1
KS = ——
k1
Стадией, определяющей скорость процесса, будет стадия распада комплекса на фермент и продукт. Она носит название лимитирующей стадии всего процесса.
Скорость реакции образования комплекса ES
v = k+1[E][S],
а скорость распада комплекса
v = k-1[ES]
При равенстве этих скоростей получим выражение:
k+1[E][S] = k-1[ES]
Разделив обе части уравнения на величину k+1, получим:
[E][S] = k-1/k+1 [ES],
где k-1/k+1 представляет собой KS. Таким образом, после приведенного преобразования выражение приобретает вид:
[E][S] = KS[ES]
В этом уравнении величину [E] можно записать как [E0] – [ES], что представляет собой концентрацию свободного фермента за вычетом концентрации фермента, связанного с субстратом. [E0] – это общая концентрация фермента в начале реакции.
[S] ([E0] – [ES]) = KS[ES]
После преобразования последнего уравнения получаем:
[S]
[ES] = [E0] ————
KS + [S]
Максимальная скорость ферментативной реакции достигается в ситуации, когда концентрация комплекса ES равна начальной концентрации фермента Е0 т.е. [ES] = [E0]. Таким образом, можно записать следующую зависимость:
V0 [ES]
—— = ——
Vmax [E0]
Поскольку из предыдущего выражения следует, что:
[ES] [S]
—— = ————
[E0] KS + [S]
то получаем:
V0 [S] [S]
—— = ———— или V0 = Vmax————
Vmax KS + [S] KS + [S]
Это последнее уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен. Графически зависимость между концентрацией субстрата и скоростью реакции отображает рис. 1.
Следует, однако, помнить, что уравнение Михаэлиса-Ментен справедливо только для начального времени реакции, когда присутствует избыток субстрата и образуется небольшое количество продукта. Именно поэтому уравнение Михаэлиса-Ментен носит несколько ограниченный характер, поскольку оно учитывает только первую часть процесса, так как истинное равновесие не может быть достигнуто. В связи с этим Холдейном и Бриггсом было предложено усовершенствованное выражение уравнения Михаэлиса-Ментен, учитывающее стадию превращения субстрата в продукт:
[S]
V0 = Vmax ————
Km + [S]
где Кm – константа Михаэлиса, которая равна концентрации субстрата (выраженной в молях/литр), при которой скорость реакции составляет половину максимальной скорости. Численное значение константы Михаэлиса может быть выражено следующим образом:
k -1 + k2
Km = ————
k1
Преобразованное Холдейном и Бриггсом уравнение Михаэлиса–Ментен, которое имеет выражение
Vmax [S]
V = ————
Km + [S]
описывает поведение многих ферментов при изменении концентрации их субстратов. Используя это уравнение можно рассмотреть несколько ситуаций, отражающих влияние [S] и Кm на начальную скорость ферментативной реакции:
1. Значение [S]намногоменьше величины Кm (точка А на рис. 1). В этом случае величину [S] в знаменателе можно опустить, и он будет практически равен величине Кm. Отношение двух постоянных величин - Vmax и Кm, можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем:
Vmax [S] Vmax [S]
V = ———— ; V @ ———— @ K[S]
Km + [S] Km
( @ означает «примерно равно»).
Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже величины Кm - начальная скорость реакции, Vо, пропорциональна концентрации субстрата [S];
2. Значение [S]намногобольше величины Кm (точка С на рис. 1). Тогда величиной Кm в знаменателе можно пренебречь, т.е.
Vmax [S] Vmax [S]
V = ———— ; V @ ———— @ Vmax
Km + [S] [S]
Это означает, что при концентрации субстрата [S], намного превышающей Кm, начальная скорость Vо приближается к максимальной скорости Vmax и не зависит от концентрации субстрата;
3. Наконец, при равенстве величин [S] и Кm (точка В на рис. 1) в знаменателе уравнения Михаэлиса-Ментен получим удвоенное значение [S].
Vmax [S] Vmax [S] Vmax [S] Vmax
V = ———— ; V = ———— = ——— = ——
Km + [S] [S] + [S] 2 [S] 2
Это означает, что при концентрации субстрата, равной Кm, начальная скорость реакции Vо составляет половину максимальной скорости - Vmax.
Графическое определение КМ и Vmax
Так как уравнение Михаэлиса-Мэнтен является уравнением гиперболы, графически определить постоянные величины КМ и Vmax довольно трудно. Поэтому уравнение Михаэлиса-Мэнтен преобразуют в уравнение прямой. Одна из них – уравнение Лайнуивера-Берка, в котором уравнение Михаэлиса-Мэнтен выражено в виде обратных величин:
1 KM + [S] 1 KM 1
— = ———— или — = ———— + ——
V Vmax [S] V Vmax [S] Vmax
Строя график 1/V от 1/[S] получим прямую линию с наклоном, равным KM/Vmax, пересекающую ось 1/V в точке 1/Vmax, а ось 1/[S] - в точке (-1/КМ) (рис. 2).
Km имеет ту же размерность, что и [S]. Линейность графикаЛайнуивера–Берка позволяет определять Km по относительно небольшому числу точек, поэтому он часто используется для расчета этого параметра. Знание величины Km позволяет определить, какое количество субстрата следует внести в реакционную смесь для определения Vmax. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое применение при анализе характера действия ингибиторов на ферментативные реакции.
Физический смысл величин КМ и Vmax
Физический смысл константы Михаэлиса Km заключается в том, что она численно равна концентрации субстрата, при которой активность фермента составляет половину максимальной.
Максимальная скорость Vmax отражает число оборотов фермента, если не известна концентрация активных центров [E], поскольку Vmax = k2 · [E].
Кинетическая константа k2 называется числом оборотов. Число оборотов фермента – это то количество молей субстрата, которое превращается в продукт реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом.
Рис. 2. График Лайнуивера–Берка в двойных обратных координатах (зависимость 1/Vо от 1/[S]), используемый для графического определения Km и Vmax.
Контрольные вопросы
1. Кинетика реакций, катализируемых ферментами
2. Уравнение Михаэлиса–Ментен
3. Графическое определение Кm и Vmax, график Лайнуивера–Берка.
4.Физический смысл величин Кm и Vmax
Литература
27. Киселев П.А., Бокуть С.Б. Курс лекций по физической химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2005, 141 С.
28. Киселев П.А., Бокуть С.Б. Курс лекций по коллоидной химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2005, 54 С.
29. Бокуть С.Б., Подобед Л.Ф., Киселев П.А., Сборник задач по физической и коллоидной химии, Учебное пособие, Минск, МГЭУ, 2007, 99 С.,
30. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия. М.: Высшая школа, 2003.
31. Физическая химия. Под ред. Краснова К.С. М.: Высшая школа, 1982.
Ход работы
| Задание | Методом разностной спектрофотометрии определить влияние различных концентраций додецилсульфата натрия на процесс окисления гемоглобина в метгемоглобин. Определить величину кажущейся константы диссоциации, KS, отражающей взаимодействие додецилсульфата натрия с молекулами гемоглобина |
1. Приготовить исходный раствор гемоглобина с концентрацией 5 ∙ 10-5 М, добавляя к навеске гемоглобина (32 мг) 10 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера рН 7,4;
2. Приготовить рабочий раствор гемоглобина с концентрацией 10-6 М объемом 15 мл. Добавить 2 мл данного раствора в спектрофотометрическую кювету и записать его как базовую линию;
3. Приготовить растворы объемом 2 мл, содержащие 10-6 М гемоглобина и 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5 ∙ 10-6 М SDS. Смеси инкубировать 5 мин при комнатной температуре и относительно базовой линии зарегистрировать разностный спектр;
4. Разностный спектр имеет максимум на 401 нм и минимум на 420 нм, что показывает изменение величины поглощения в области полосы Соре, которое указывает на переход метгемоглобина в его низкоспиновую форму - гемихром. Определяют параметр ΔD между λmax и λmin.
5. Рассчитать значения 1/[SDS] и 1/ΔD. Данные занести в таблицу.
6. Методом двойных обратных величин в координатах Лайнуивера-Берка (1/ΔD от 1/[SDS]) определить значение кажущейся константы диссоциации Ks, отражающей взаимодействие додецилсульфата натрия с молекулами гемоглобина.
Таблица
| № опыта | [SDS], мкМ | ΔD | 1/[SDS], мкМ-1 | 1/ΔD |
| 1. | 1,5 | |||
| 2. | 3,0 | |||
| 3. | 4,5 | |||
| 4. | 6,0 | |||
| 5. | 7,5 |
Оформление работы
К занятию:
1. Кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной работе.
Во время занятия:
2. Описать этапы работы.
3. Заполнить таблицу.
4. Начертить калибровочные графики.
5. Оформить результаты измерений.
6. Сделать выводы.