Методические указания к практической работе
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ И ИММУНОЛОГИИ
Хабаровский филиал
Федерального государственного бюджетного учреждения
«Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания»
Сибирского отделения Российской академии медицинских наук – НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ОХРАНЫ МАТЕРИНСТВА И ДЕТСТВА
МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ
РУКОВОДСТВО
К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ
Часть 2
ХАБАРОВСК
УДК 616:579.61 (076.5)
ББК 52.64 я 73
К 626
Рецензенты:
И. В. Хелимская д.м.н., доц.
кафедры госпитальной терапии
И.Г. Яковенко к.м.н.,
доцент зав кафедрой патологической физиологии
Кольцов И.П.
Микробиология, вирусология руководство к практическим занятиям для студентов 2-3 курсов лечебного факультета//И.П.Кольцов, Е.П. Когут, А.С.Соловьева, Г.Н. Холодок, Е. В. Тазалова, Н.В. Стрельникова. Часть 2. – Хабаровск: Изд-во ГБОУ ВПО ДВГМУ, 2014. – 136 с.
Руководство составлено в соответствии с приказом Минобрнауки России «Об утверждении и введении в действие федерального государственного образовательного стандарта (ФГОС-3) высшего профессионального образования по направлению подготовки (специальности) 060101 «Лечебное дело» (квалификация (степень) «специалист») от 08 ноября 2010 г N 1118. Зарегистрирован в Минюсте России от 20 декабря 2010 г. N 19261.
Содержит планы практических занятий, контрольные вопросы, рекомендации к практической работе, дополнительный материал.
Предназначено для студентов 2-3 курсов лечебного факультета
Утверждено
Центральным методическим советом
ГБОУВПО ДВГМУ
в качестве руководства к практическим занятиям для 2- 3 курсов
студентов, обучающихся по специальности 060101- «Лечебное дело»
Печатаются по решению ЦМС ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет Минздрава России
© Издательство ДВГМУ, 2014
Занятие 1
ТЕМА. Риккетсии. Rickettsia. Классификация риккетсиозов. Rickettsia prowazekii (возбудитель сыпного тифа). Лабораторный диагноз сыпного тифа. Профилактика сыпного тифа. R.sibirica. Coxiella bumetti.Общая характеристика и методы культивирования риккетсий. Лабораторный диагноз риккетсиозов
Цель занятия.Рассмотреть основные свойства возбудителей риккетсиозов, роль их в патологии человека, эпидемиологию сыпного тифа и других риккетсиозов; разобрать методы лабораторной диагностики сыпного тифа; ознакомить с препаратами для специфической профилактики и терапии сыпного тифа
Методические указания к практической работе
Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)
Место проведения занятия: учебная аудитория
Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины
Хронометраж практического занятия:
1. Вводное слово преподавателя – 5 мин
2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин
3. Разбор теоретических вопросов по теме: «Rickettsia. Rickettsia
prowazekii» – 80 мин
a. Возбудители, вызывающие сыпной тиф
b. Механизм заражения человека сыпным тифом
c. Особенности патогенеза сыпного тифа
d. Особенности иммунитета при сыпном тифе
e. Болезнь Брилля
f. Методы микробиологической диагностики сыпного тифа
g. Диагностическая ценность реакции агглютинации
h. Диагностическая ценность РСК при сыпном тифе
i. Диагностическая ценность РПГА при сыпном тифе
j. Особенности эпидемиологии клещевого риккетсиоза Северной Азии
k. Особенности эпидемиологии Ку-лихорадки
l. Препараты, применяющиеся для специфической профилактики сыпного тифа и Ку-лихорадки
4. Выполнение практической работы – 35 мин
Практическая работа
1. Изучение мазков риккетсии Провачека, окрашенных фуксином с подогреванием(зарисовать)
Риккетсии, в отличие от бактерий, плохо окрашиваются обычными анилиновыми красителями, поэтому для их окраски используют методы, основанные на протравливании. Риккетсии окрашиваются в красный цвет.
2. Изучение лабораторной диагностика сыпного тифа и других риккетсиозов(составить схему методов диагностики и зарисовать)
Лабораторная диагностика сыпного тифа и других риккетсиозов включает выделение возбудителя, определение его антигенов и ДНК, выявление антител к риккетсиям соответствующих видов. Чаще осуществляется с использованием серологических (РСК, РНГА, РНИФ, ИФА) и молекулярно-генетических (ПЦР, определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов) методов.
Методы выделения и последующей идентификации риккетсий требуют специальной подготовки, соблюдения режимных требований (возбудители 2–3-й группы патогенности).
К возбудителям второй группы патогенности относят R. prowazekii, Coxiella burnetii, R. rickettsii. Их культивирование можно осуществлять в специализированных риккетсиологических лабораториях или лабораториях особо опасных инфекций, что ограничивает возможности использования методов выделения риккетсий в диагностических целях. Выделение возбудителей риккетсиозов от больных наиболее эффективно в острый лихорадочный период, до начала антибиотикотерапии. Основные риккетсиологические методы включают заражение, чаще интраперитонеальное, чувствительных животных (морские свинки, хомячки, хлопковые и белые крысы, белые мыши), развивающихся куриных эмбрионов (в желточный мешок по Коксу), перевиваемых культур клеток (Vero, HeLa, Нер-2, L929), клеток членистоногих.
Животным и при заражении куриных эмбрионов вводят дефибринированную кровь или суспензию растертых на физиологическом растворе сгустков крови, биопсийного материала кожи, а также других тканей больного в зависимости от формы поражений.
При заражении клеточных культур используют плазму, гепаринизированную (или обработанную ЭДТА) кровь, биопсийный материал. Целесообразно выделение возбудителя не только от больного, но и из переносчиков (клещи, блохи, вши). Эффективно риккетсиологическое обследование снятых с человека переносчиков классическими (выделение возбудителя) и экспресс-методами (метод флюоресцирующих антител, ИФА, РНГА с иммуноглобулиновыми диагностикумами для выявления антигенов риккетсий групп СТ и КПЛ).
Для биопроб используют молодых, весом 300–350 г морских свинок-самцов. Заражение проводят внутрибрюшинным введением 3–5 мл крови или 10 %-ной суспензии материалов, содержащих риккетсий (сгустки крови и органы человека и животных, членистоногие), двум-трем животным. У животных ежедневно измеряют ректальную температуру. После инкубационного периода от нескольких дней до нескольких недель у морских свинок развиваются различные формы экспериментальных риккетсиозов (лихорадочные, лихорадочно-скротальные, бессимптомные). При заражении R. rickettsii, реже – О. tsutsugamushi и С. burnetii у морских свинок может возникать летальная инфекция. Наиболее характерным для риккетсиозов проявлением экспериментальной инфекции у морских свинок-самцов при внутрибрюшинном заражении является скротальный феномен – периорхит с накоплением риккетсий во влагалищных оболочках яичка. В ряде случаев может возникать специфический перитонит, риккетсии накапливаются в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов различных органов и тканей (тестикулы, мозг, селезенка, надпочечники). Животных вскрывают на высоте лихорадки, одно из биопробных животных оставляют для серологического исследования (как правило, через 3–4 недели после заражения).
При всех формах инфекционного процесса у биопробных животных выявляют антитела к антигенам риккетсий в различных серологических реакциях (РА, РСК, РНИФ, ИФА). Используют цельнорастворимые и корпускулярные антигены из штаммов различных видов риккетсий. В большинстве серологических реакций отмечается выраженная перекрестная реактивность внутри групп (СТ и КПЛ). Для анализа антигенной структуры риккетсий чаще используют гипоиммунные сыворотки белых мышей и корпускулярные антигены.
Культивирование в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов более эффективно для накопления риккетсий по сравнению с биопробными животными. Однако первичное выделение штаммов риккетсий на куриных эмбрионах проводят редко в связи с высокой вероятностью контаминации посторонней микрофлорой, преимущественно для выделения гемокультур. Обычно куриные эмбрионы при выделении штаммов заражают пассажным материалом от зараженных лабораторных животных (чаще – суспензии тестикул, селезенок, головного мозга). При культивировании учитывают сроки гибели зараженных эмбрионов, видимые изменения (геморрагические поражения), интенсивность накопления риккетсий. Погибшие в течение 3 суток после заражения эмбрионы отбраковывают (неспецифические проявления, чаще – травматическая гибель). Развитие инфекции в клеточных культурах у различных видов родов Rickettsia и Orientia отличается. Для риккетсий Провачека и ориенций Цуцугамуши характерно накопление микроорганизмов в больших количествах в отдельных клетках. Дегенеративные изменения клеток вследствие перепроизводства возбудителя сопровождаются их разрывом и освобождением микроорганизмов с распространением инфекции на соседние клетки. Для группоспецифической идентификации риккетсий группы клещевых пятнистых лихорадок (КПЛ) можно использовать РСК с сыворотками крови биопробных морских свинок и цельнорастворимыми антигенами оригинальных штаммов риккетсий и музейных штаммов известных видов. Дифференциация риккетсий группы КПЛ ранее базировалась преимущественно на учете их токсических свойств, а также использовании корпускулярных антигенов и иммунных мышиных сывороток для идентификации риккетсий. Можно использовать метод флюоресцирующих антител с мазками-отпечатками желточных мешков куриных эмбрионов, ИФА и РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом для выявления риккетсий группы КПЛ и сыпного тифа.
Дальнейшая идентификация проводится в перекрестной РСК с сыворотками мышей чистых линий (СВА) и набором антигенов риккетсий. В РНИФ с моноклональными антителами к риккетсиям, а также с помощью генетических методов (рестрикционный анализ ДНК, ДНК-зондирование, полимеразная цепная реакция с использованием праймеров области гена цитратсинтазы и белкового антигена 190 кДа с последующим определением нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК и др.).
3. Изучение серологического метода диагностики риккетсиозов(составить схему и записать в тетрадь)
Реакцию Вейля-Феликса с протейными антигенами варианты реакции агглютинации со специфическими риккетсиальными антигенами в настоящее время практически не применяют в связи с недостаточной чувствительностью и специфичностью.
Существует более чувствительный метод микроагглютинации с меченными флюорохромом риккетсиями для серодиагностики риккетсиозов группы сыпного тифа (СТ), однако, не нашедший широкого применения в практике.
В течение многих десятилетий РСК являлась базовым методом серологической диагностики риккетсиозов. Метод обладает высокой групповой специфичностью даже при низких (1:10-1:20) разведениях сывороток, однако недостаточно чувствителен в ранней фазе заболевания.
Комплементсвязывающие антитела при большинстве риккетсиозов групп СТ и КПЛ выявляют в конце первой – начале второй недели инфекции, в некоторых случаях – в более поздние сроки. Наличие группоспецифического полисахаридного комплекса в составе препарата растворимого антигена для РСК приводит к отсутствию четкой видовой дифференциации внутри групп СТ и КПЛ, хотя титры антител обычно бывают выше к гомологичному антигену.
Группоспецифическая диагностика риккетсиозов группы КПЛ в РСК в России осуществляется с растворимым антигеном R. sibirica, в Америке – R. rickettsii, в Европе – R. conorii, что определяется распространением важнейших риккетсиозов этой группы – клещевого сыпного тифа Северной Азии, пятнистой лихорадки Скалистых гор и марсельской лихорадки соответственно. Более четкая видовая дифференциация внутри групп осуществляется с помощью корпускулярных антигенов, однако чаще не в РСК, а в РНИФ. Антигены и другие ингредиенты для РСК выпускают в Пермском филиале НПО «Микроген».
Реакцию непрямой гемагглютинации применяют для диагностики риккетсиозов как группы СТ, так и группы КПЛ. В качестве гемосенситина используют комплекс ЛПС и белковых антигенов. В нашей стране метод применяется преимущественно для выявления антител к риккетсиям группы СТ. Препарат выпускают в Пермском филиале НПО «Микроген». РНГА – наиболее ранний, чувствительный метод выявления текущей (острой) риккетсиозной инфекции, выявляет преимущественно IgM-антитела, быстроисчезающие после перенесения инфекции. Латекс-агглютинация в целом близка по своим параметрам к РНГА, используется как метод первичного тестирования сывороток крови, группоспецифична, выявляет как IgM-, так и IgG-антитела, в связи с высокой перекрестной реактивностью внутри группы СТ не позволяет дифференцировать эпидемический и эндемический сыпной тиф.
Иммуноферментный анализ применяют для серодиагностики риккетсиозов групп СТ и КПЛ, лихорадки Цуцугамуши. Применяют различные варианты ИФА с использованием ренографиночищенных антигенов для сенсибилизации планшет. По чувствительности и специфичности ИФА сопоставима с РНИФ, однако имеет некоторые преимущества для выявления антител в низких титрах (у вакцинированных, в период поздней реконвалесценции), что можно использовать при ретроспективном эпидемиологическом анализе. В России выпускают тест-системы ИФА для выявления антигенов коксиелл Бернета и антител к ним (Санкт-Петербургский НИИ ЭМ им. Пастера). В последние годы в Омском НИИ природно-очаговых инфекций разработан ИФА для выявления антител к риккетсиям группы КПЛ, показана эффективность применения ИФА с антигеном R. sibirica для диагностики клещевого риккетсиоза.
Реакция непрямой иммунофлюоресценции считается «золотым стандартом» серодиагностики риккетсиозов, используемым в большинстве лабораторий. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, воспроизводимостью, позволяет выявлять IgM- и IgG-антитела как вместе, так и раздельно в зависимости от применяемых конъюгатов. При риккетсиозах группы КПЛ и лихорадке Цуцугамуши диагностически значимые титры IgM-антител выявляют в конце первой недели, IgG-антител – в конце второй недели заболевания. В России корпускулярных антигенов для РНИФ не выпускают. Методом подтверждения стандартных серологических методов диагностики является иммуноблотт. Показано, что перекрестно-реагирующие антитела направлены против ЛПС и относятся к IgM-антителам, IgG-антитела образуются как к ЛПС, так и к белковым антигенам риккетсий. Коммерческие наборы для иммуноблотта находятся в стадии разработки.
Молекулярно-биологическиеметоды. Генетические методы находят все более широкое применение для изучения и идентификации риккетсий. Среди них используют анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ), метод геномной дактилоскопии (ДНК-зонды), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированной в полимеразной цепной реакции ДНК (ПДРФа ДНК ПЦР), пульсовый гелевый электрофорез, метод сравнения нуклеотидных последовательностей.
Рестрикционный анализ требует для своего осуществления большого количества ДНК, что на первых этапах генетического изучения риккетсий требовало накопления биомасс риккетсий на чувствительных моделях (желточные мешки куриных эмбрионов, культуры клеток). Использование методов, основанных на полимеразной цепной реакции, является более рациональным. При этом не только не требуется длительное культивирование микроорганизмов, но часто эти варианты генетического анализа оказываются более чувствительными и специфичными.
4. Изучение бактериологического метода выделения Coxiella burnetti(нарисовать схему диагностики)
Диагноз лихорадки Ку вследствие полиморфизма клиники невозможен без лабораторного подтверждения. Основной метод – РСК. Наряду с ним используют более чувствительные методы – РНИФ и ИФА. У больных преобладают антитела к антигену C. burnetii фазы 2; антитела к антигену фазы 1 преобладают при формировании хронического течения.
Возбудитель Ку-лихорадки выделяют из крови, мокроты, ликвора, грудного молока или мочи больных с использованием тканевых сред. Для постановки биологической пробы используют морских свинок, белых мышей и крыс. У морских свинок через 7 дней после заражения развивается лихорадка. Риккетсии Coxiella burnetti в большом количестве накапливаются в печени, селезенке и других органах. Иногда у морских свинок после заражения бывает бессимптомное течение инфекции, что заставляет прибегать к постановке серологических реакций с целью окончательной диагностики. Специфичность инфекции удается доказать иногда только через нескольких пассажей. Чистые культуры выделяют путем введения в желточный мешок куриных эмбрионов исследуемого материала.
5. Изучение серологических методов диагностики Ку-лихорадки(записать в тетрадь, оформить протокол)
Серодиагностика наиболее проста, доступна и не менее надежна. Обычно применяют реакцию связывания комплемента и реакцию агглютинации. В РСК с антигеном диагностический титр 1:8- 1:16 выявляется с 10–12-го дня болезни (с антигеном II фазы) и достигает максимального значения на 3–4-й неделе болезни (с антигеном I фазы). Комплементсвязывающие антитела в низких титрах выявляются у реконвалесцентов в течение ряда лет. Надежным методом диагностики является иммунолюминесцентный метод исследования. Для непосредственной и ретроспективной диагностики Ку-лихорадки предложена внутрикожная проба. Трудности приготовления стандартного антигена лишают ее практической ценности, хотя при эпидемиологических и эпизоотологических обследованиях эта проба могла бы быть полезной.
6. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения риккетсиозов(записать в тетрадь)
Вакцина Е сыпнотифозная, живая. Живые авирулентные риккетсии Провачека. Селекция авирулентного штаммма риккетсии Провачека. Профилактика по эпидемическим показаниям. Создание активного иммунитета.
Вакцина сыпнотифозная химическая. Содержит растворимый антиген (химический способ) из вирулентных риккетсии Провачека. Профилактика по эпидемическим показаниям. Создание активного иммунитета. Вакцина М-44 живая. Содержит аттенуированный (ослабление вирулентных штаммов) штамм С. Burneti. Используется для профилактики по эпидемическим показаниям. Создание активного иммунитета.
Занятие 2
ТЕМА. Клостридии. Clostridium. Clostridium perfringens.Морфология, культуральные и биологические свойства возбудителей анаэробной раневой инфекции. Лабораторный диагноз анаэробной раневой газовой инфекции (газовой гангрены). Специфическая терапия и профилактика анаэробной газовой инфекции. Cl.botulinum. Морфология, культуральные и биологические свойства возбудителя ботулизма. Лабораторный диагноз ботулизма. Специфическая профилактика ботулизма. Cl.tetani. Морфология, культуральные и биологические свойства возбудителя столбняка. Лабораторный диагноз столбняка. Специфическая профилактика и терапия столбняка
Цель занятия.Рассмотреть свойства возбудителей анаэробной раневой инфекции, разобрать методы микробиологической диагностики, изучить препараты для специфической профилактики и терапии газовой анаэробной инфекции. Рассмотреть характеристику палочек ботулизма, ознакомить студентов с принципами лабораторной диагностики ботулизма. Изучить основные свойства возбудителя столбняка, ознакомить студентов с методами лабораторной диагностики столбняка, препаратами специфической диагностики, терапии и профилактики столбняка
Методические указания к практической работе
Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)
Место проведения занятия: учебная аудитория
Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины
Хронометраж практического занятия:
1. Вводное слово преподавателя – 5 мин
2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин
3. Разбор теоретических вопросов по теме «Clostridium perfringens»
– 25 мин
a. Характеристика возбудителей анаэробной раневой инфекции
b. Патогенез заболевания
c. Лабораторная диагностика анаэробной раневой инфекции
d. Специфическая профилактика и терапия раневой инфекции
4. Разбор теоретических вопросов по теме «Clostridium tetani» – 25
мин
a. Характеристика возбудителей столбняка
b. Эпидемиология и патогенез столбняка
c. Лабораторный диагноз столбняка
d. Специфическая профилактика и терапия столбняка
5. Разбор теоретических вопросов по теме «Clostridium botulinum» –
30 мин
a. Характеристика палочек ботулизма
b. Токсинообразование у палочек ботулизма
c. Эпидемиология и патогенез ботулизма
d. Лабораторная диагностика ботулизма
e. Специфическая профилактика и терапия ботулизма
6. Выполнение практической работы – 35 мин
Практическая работа
Clostridium perfringens
1. Изучение мазка из чистой культуры Cl.perfringens, окрашенного по Граму(зарисовать)
В поле зрения видны крупные полиморфные грамположительные палочки (старые клетки грамотрицательные) с закругленными концами. Видны споры овальной формы, превышающие диаметр палочки, расположенные центрально или субтерминально (зарисовать).
2. Изучение колонии клостридий в глубине агара в пастеровских пипетках(зарисовать)
Сделан посев почвы на сахарный агар, расплавленный и остуженный до 45 °. После перемешивания агара, им наполняют пастеровские пипетки путем насасывания. Тонкий конец запаивают. После суточного инкубирования в глубине агара вырастают колонии в виде чечевичных зерен, расположенные под углом друг к другу в виде «парашютиков», «самолетиков» или в виде пушинок и комочков ваты. При обнаружении подозрительных колоний пипетку распиливают, а колонию отсевают на среду Китта-Тароцци.
3. Изучение среды Китта-Тароцци (зарисовать, указать ингредиенты)
Это специальная среда для культивирования анаэробов, содержит питательный бульон, которым заливают кусочки печени или мяса. В качестве редуцирующего вещества добавляют 0,5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят, быстро остужают до 45 °, засевают, не дав среде насытиться кислородом, и заливают слоем вазелинового масла. При росте клостридий среда мутнеет, может наблюдаться газообразование (зарисовать, записать ингредиенты)
Изучение анаэростата
Анаэростат - это прибор, в котором осуществляют культивирование анаэробов. Он герметически закрывается, из него выкачивают воздух, оставляют вакуум или замещают его индифферентным газом или смесью азота и углекислого газа. Этот аппарат можно использовать для химического поглощения кислорода из воздуха. Для этого, после размещения чашек и пробирок с посевами, в него помещают вещества, поглощающие кислород, и герметически его закрывают
5. Изучение микробиологического диагноза анаэробной раневой инфекции по схеме(записать в тетрадь)
Анаэробная раневая инфекция - тяжелое острое поликлостридиальное заболевание, осложняющее течение травм (ожогов, ранений, отморожений). Раневая инфекция может быть вызвана клостридиями, как ассоциацией клостридий, так и смесью патогенных и апатогенных клостридий с аэробными бактериями. Клостридии газовой гангрены, благодаря продукции ферментов и экзотоксинов, обладают высокой токсигенностью.
Микробиологическая диагностика может быть использована для коррекции серотерапии. В качестве материала для исследования собирают экссудат из раны, кусочки измененной ткани из раны, инородные тела, попавшие в рану, кровь. Микробиологическое исследование направлено на выделение клостридий или выявление их токсинов.
Основными методами микробиологического исследования являются:
- микроскопический;
- бактериологический;
- биологический
Микроскопический метод.Из патологического материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Обнаружение в мазках грамположительных коротких с обрубленными концами, окруженных капсулой палочек позволяет ориентировочно диагностировать Cl.perfringens. При соответствующей клинической картине в этом случае бактериоскопия имеет диагностическое значение. Если в препарате обнаружены палочки другой морфологии, ориентировочного ответа не дают.
Cl.novyi представляют собой палочки до 10 мкм длиной, 1 мкм шириной, несколько искривленные с закругленными концами. Похожи на них, но несколько короче и тоньше, Cl.septicum. У этого микроба часто наблюдается полиморфизм, имеются нитевидные формы. Оба вида капсулу не образуют. У Cl.histolyticum нет особых морфологических признаков, при анаэробной инфекции этот возбудитель встречается редко. При микроскопии обращают внимание на сопутствующую аэробную флору, так как она осложняет инфекционный процесс. Учитывая быстрое развитие клиники, необходимо быстро дать ориентировочный ответ. Для этого используют метод иммунофлюоресценции.
Бактериологический метод. Бактериологический метод применяют для выделения культуры клостридий. Для этого исследуемый материал засевают на специальные среды, обеспечивающие рост анаэробов: сахарный агар, кровяно-сахарный агар, среды Китта-Тароцци, Вильсон-Блера, инкубируют в термостате или эксикаторе. Посевы в пробирки дублируют, потому что для уничтожения аэробных микробов один экземпляр посевов прогревают. Посевы наблюдают 8 дней, просматривая их каждые 2 дня. Изучают выросшие колонии. На среде Вильсон-Блера колонии черного цвета. На кровяном агаре колонии круглые, гладкие с зеленоватой зоной гемолиза (Cl.perfringens), шероховатые с гемолизом (Cl.novyi, Cl.oedematiens), мелкие гладкие без гемолиза (Cl.histolyticum), с нежным кружевным ростом и гемолизом (Cl.septicum). В столбике с сахарным агаром вырастают дискообразные колонии (Cl.perfringens), пушистые с плотным центром (Cl.novyi, Cl.oedematiens), хлопьевидные (Cl.septicum), мелкие, плотные, комочками (Cl.histolyticum).
После микроскопии подозрительных на анаэробы колоний делают пересев отдельных колоний на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры. Чистую культуру идентифицируют по биохимическим (табл.1), антигенным и токсигенным свойствам.
Токсигенные свойства определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. Для этого культуральную жидкость разливают в 6 пробирок и в каждую из 5 добавляют антитоксические противогангренозные сыворотки, в 6 пробирку добавляют физиологический раствор. Смесь выдерживают при комнатной температуре 40 минут и вводят внутривенно белым мышам. При соответствии токсина и антитоксина произойдет нейтрализация токсина и мыши, которым введена нейтральная смесь, останутся живыми, контрольные же погибнут.
Биологический метод.Биологический метод используется для обнаружения токсина в крови и другом исследуемом материале. Для этого материал смешивают с антитоксическими противогангренозными сыворотками: анти-перфрингенс, анти-эдематиенс, анти-вибрио, анти-гистолитикум, анти-сордели, для контроля материал смешивают с физиологическим раствором. Смесь выдерживают 40 минут для взаимодействия и вводят внутрибрюшинно белым мышам. Видовую принадлежность токсина устанавливают по выжившим мышам, при гибели мышей контрольной и остальных опытных групп.
В случае гибели всех мышей реакцию нейтрализации повторяют с типовыми А, В, Д, Е диагностическими сыворотками Cl.perfringens. Вместо мышей можно брать морских свинок, монослой культуры клеток или 10-дневные куриные эмбрионы. При ускоренной диагностике определяют тип токсина в исследуемом материале реакцией преципитации в геле, нейтрализации антителами лецитиназной активности клостридий, изменение морфологии и культуральных свойств при выращивании клостридий в присутствии специфических антител.
Таблица 1