Методические указания к практической работе. Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)
Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)
Место проведения занятия: учебная аудитория
Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины
Хронометраж практического занятия:
1. Вводное слово преподавателя – 5 мин
2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин
3. Разбор теоретических вопросов по теме – 50 мин
a. Характеристика стрептококков
b. Токсины и ферменты патогенности стрептококков
c. Современная классификация стрептококков
d. Роль стрептококков в патологии человека. Стрептококковые инфекции
e. Лабораторный диагноз острых стрептококковых инфекций
f. Лабораторный диагноз хронических стрептококковых инфекций
4. Разбор теоретических вопросов по теме – 30 мин
a. Пневмококки, их свойства
b. Формы пневмококковой инфекции
c. Эпидемиология пневмококковой инфекции
d. Лабораторная диагностика пневмококковой инфекции
e. Дифференциация пневмококков от зеленящих стрептококков
5. Выполнение практической работы – 35 мин
Практическая работа
1. Изучение мазка из чистой культуры стрептококка, окрашенного по Граму (зарисовать)
В мазке, окрашенном по Граму, видны грамположительные кокки, располагающиеся цепочками, иногда цепочки очень длинные, проходят через все поле зрения.
2. Изучение мазка из гноя, окрашенного по Граму(зарисовать)
На розовом фоне, который образует клеточный детрит, видны лейкоциты, а между ними грамположительные кокки, располагающиеся в виде коротких цепочек (3–4 кокка) или парами.
3. Изучение характера роста стрептококков на кровяном агаре(зарисовать):
По характеру роста на кровяном агаре стрептококки делятся на:
3.1. бета-гемолитические стрептококки, они образуют на кровяном агаре мелкие колонии с большой зоной полного просветления среды вокруг них. Бета-гемолизин действует на строму эритроцитов, разрушая их, поэтому в зоне гемолиза эритроциты не видны
3.2. альфа-гемолитические стрептококки, они растут на кровяном агаре в виде мелких сероватых колоний с гладкой или шероховатой поверхностью, окруженных полупрозрачной зеленоватой зоной гемолиза. Альфа-гемолизин действует на гемоглобин, превращая его в метгемоглобин. В зоне гемолиза под малым увеличением видны тени эритроцитов. Так как зона имеет зеленоватый цвет, эти стрептококки названы зеленящими.
3.3. негемолитические стрептококки, они образуют мелкие колонии, кровяной агар не изменяют.
4. Изучение лабораторной диагностики стрептококковых инфекций по схеме (зарисовать)
При острых формах стрептококковых инфекциях применяют методы:
- микроскопический
- бактериологический
При хронических заболеваниях используют
- серологический метод
Идентификация Str.рyogenes проводится на основании:
- морфологических особенностей роста
- фенотипических характеристик
• каталазная реакция
• определение чувствительности к бацитрацину
• постановка PYR-теста
- антигенной структуры (серологический метод)
Микроскопический метод. Метод основан на обнаружении стрептококков в исследуемом материале. Из гноя, отделяемого ран, осадка мочи готовят мазки, окрашивают их по Граму. Обнаружение грамположительных кокков в виде коротких цепочек или расположенных парами позволяет поставить ориентировочный диагноз.
Бактериологический метод. Метод основан на выделении чистой культуры стрептококка на питательных средах. Исследуемый материал засевают на плотные и жидкие питательные cреды. Питательные потребности стрептококков сложные, на МПА они не растут, особенно в первых генерациях. Поэтому используют для посева cреды с добавлением крови, сыворотки, углеводов. Более информативен посев на кровяной агар с 5% бараньих эритроцитов, так как на нем виден характер гемолиза. Материал с тампона размазывают по поверхности 5% кровяного агара, но не втирают его в агар. Затем ополаскивают тампон в сахарном бульоне. Посев крови проводят у постели больного с последующим высевом на кровяной агар. Все посевы помещают в термостат на 18-20 часов.
На следующий день просматривают посевы на жидких средах. При наличии роста делают пересев на кровяной агар. На жидких питательных средах патогенные стрептококки дают придонно-пристеночный рост с образованием мелкокрошковатого осадка, бульон остается прозрачным. В мазке культуры из бульона видны длинные цепочки грамположительных кокков. Просматривают колонии на кровяном агаре. Гемолитическая реакция является важной в идентификации пиогенного стрептококка. Гемолиз обусловлен действием кислородолабильного стрептолизина О. Str.рyogenes образует три типа колоний:
- матовые (круглые колонии серовато-белого цвета 1–2 мм в диаметре с характерным, слегка приподнятым центром);
- слизистые (колонии правильной круглой формы, блестящие, напоминающие своим видом капельки росы, диаметр колонии 2–2,5 мм). Такие микроорганизмы продуцируют много гиалуроновой кислоты;
- гладкие (относительно небольшие колонии 1 мм в диаметре, сферической формы, с ровным краем и блестящей влажной поверхностью).
Другие виды стрептококков, относящиеся к β-гемолитическим серогруппы А, формируют очень мелкие колонии, адкиее
ри типа колоний:ием стрептолизина Онтификации пиогенного стрпетококка. зона гемолиза вокруг них значительно превышает размеры колоний.
Для дальнейшего изучения, отбирают мелкие сероватые колонии, окруженные зоной полного гемолиза или зеленоватой зоной. Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму. В препарате видны грамположительные кокки, располагающиеся короткими цепочками по 2–4.
На принадлежность к роду стрептококков указывает морфология, характер роста на кровяном агаре и сахарном бульоне. Для определения принадлежности выделенной культуры к определенному виду проводят дополнительные исследования: фенотипические методы идентификации. Str.рyogenes дает отрицательную каталазную реакцию. Str.рyogenes обладает чувствительностью к антибиотику бацитрацину. Зона задержки роста ≥12 мм. Str.рyogenes продуцируют фермент пирролидонил пептидазу (PYR-аза), который разрушает L-пирролидонил в-нафтиламид при добавлении реагента (0,01% циннамальдегида), возникает красное окрашивание.
Серологический метод идентификации. Метод основан на выявлении группового полисахарида клеточной стенки. Этот полисахарид не является поверхностной структурой клеточной стенки. Для взаимодействия со специфическими антителами, содержащимися в сыворотке, необходимо провести экстракцию антигена. Экстракция может быть проведена с помощью кислоты или ферментов. Реакцию взаимодействия антигена с антителом определяют по видимой агглютинации (тест коагглютинации и латекс-агглютинации), по изменению цвета (хроматографический тест), либо по другим изменениям в зависимости конкретной тест-системы.
Дифференциацию стрептококков на серовары проводят только в группе А с помощью реакции иммунопреципитации по белковому антигену М. М – белок высокоспецифичный антигенный маркер и фактор вирулентности. Стрептококки можно типировать по Т-антигену с помощью реакции агглютинации.
Серологическая диагностика применяется при подтверждении диагноза, как правило, ревматизма. Она основана на обнаружении антител против стрептолизина О, антистрептокиназы, антидезоксирибонуклеазы В, антигиалуронидазы. Антистрептолизины определяют в реакции нейтрализации – способности стрептолизина О растворять эритроциты. Антигиалуронидазу и антифибринолизин также определяют в реакции нейтрализации.
Str.pneumoniae
1. Изучение мазка из чистой культуры Str.pneumoniae, окрашенного по Граму(зарисовать)
В мазках из чистых культур видны грамположительные ланцетовидные диплококки, иногда расположенные в виде коротких цепочек.
2. Изучение мазка из мокроты больного пневмонией, окрашенного по Граму (зарисовать)
В мазке, окрашенном по Граму, на розовом фоне клеточного детрита видны грамположительные ланцетовидные диплококки, окруженные бесцветной капсулой.
3. Изучение мазок-отпечаток из органов мыши, зараженной мокротой (зарисовать)
В мазке, окрашенном по Граму, на фоне клеточных элементов органов, окрашенных в розово-фиолетовый цвет, видны грамположительные ланцетовидные диплококки, окруженные бесцветной капсулой.
4. Изучение роста пневмококка на кровяном агаре (зарисовать)
Пневмококки образуют альфа-гемолизин, поэтому на кровяном агаре вырастают в виде полупрозрачных мелких нежных плоских колоний со слегка вдавленным центром за счет аутолиза, окруженные зеленоватой зоной гемометаморфоза.
5. Изучение тестов, дифференцирующих пневмококки от других видов по схеме(записать в тетрадь)
Так как по морфологии и характеру роста бывает трудно дифференцировать пневмококк от энтерококка и группы «зеленящих стрептококков», для их отличия рекомендуются оптохиновый, желчный и другие тесты (табл.12).
Таблица 12