Методические указания к практической работе. Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)
Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)
Место проведения занятия: учебная аудитория
Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины
Хронометраж практического занятия:
1. Вводное слово преподавателя – 5 мин
2. Проверка исходного уровня знаний (тест – контроль) – 15 мин
3. Разбор теоретических вопросов по теме «Mycobacterium tuberculosis» – 60 мин
a. Морфология и биология туберкулезных палочек
b. Культуральные свойства туберкулезных палочек
c. Особенности иммунитета
d. Эпидемиология туберкулеза
e. Лабораторная диагностика туберкулеза
f. Аллергодиагностика туберкулеза
g. Туберкулин, его препараты
h. Диаскин-тест
i. Вакцинопрофилактика туберкулеза
4. Разбор теоретических вопросов по теме «Mycobacterium leprae» - 20 мин
a. Характеристика возбудителя лепры
b. Лабораторная диагностика лепры
5. Выполнение практической работы – 35 мин
Практическая работа
1. Изучение мазков из мокроты больного туберкулезом(зарисовать)
В мазке, окрашенном по Цилю-Нильсену, на синем фоне видны окрашенные в ало-красный цвет туберкулезные бактерии в виде тонких, прямых или слегка изогнутых палочек, часто зернистых, расположенных поодиночке или небольшими кучками. Синий цвет имеют лейкоциты, слизь, другая микробная флора мокроты.
2. Изучение роста микобактерии на среде Левенштейна-Йенсена(зарисовать)
Вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотной среде в виде R-колоний. Колонии сухие, морщинистые, кремового цвета с чуть приподнятым центром и изрезанным краем. Средняя продолжительность роста 20–46 дней, поэтому посевы выдерживают в термостате в течение 2–3 месяцев, для предотвращения высыхания среды ватные пробки заливают смесью воска (1/3) с парафином (2/3).
3. Изучение бактериологической диагностики туберкулеза по схеме (записать схему диагностики в тетрадь)
Лаборатория противотуберкулезной службы должна быть готова получить любой биологический материал на исследование туберкулеза (мокрота, отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозольной ингаляции, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярные смывы (БАС), бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), транстрахеальный биоптат, внутрилегочный биоптат, аспират из бронхов, мазки из гортани, экссудат, промывные воды желудка, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, перикардиальная жидкость, синовиальная жидкость, асцитическая жидкость, материал, полученный при бронхоскопии, кровь, гной, гнойно-некротические массы, пунктат костного мозга, резецированная ткань, грануляции, соскоб синовиальных оболочек, лимфатические узлы или их пунктат).
При проведении бактериологического исследования необходимо учитывать, как собран материал. Материал может быть собран как в асептических, так и в антисептических условиях. Асептически собранный материал, как правило, не содержит другую микрофлору. Биологические жидкости (ликвор, перикардиальная, синовиальная, асцитическая, кровь, костный мозг) должны собираться врачом в асептических условиях в стерильный контейнер с использованием соответствующих методик. К жидкостям, имеющим склонность к свертыванию, добавляются стерильные гепарин (0,2 мг на мл) или оксалат калия (0,01–0,02 мл 10% нейтрального оксалата на 1 мл материала).
Материал должен доставляться в лабораторию немедленно. Асептически собранные ткани помещаются в стерильные контейнеры без добавления каких-либо консервантов. В случае длительной транспортировки ткани необходимо поместить в стерильный физраствор, обложить сухим льдом или охладить при температуре 4-15 °С. Следует немедленно доставлять материал в лабораторию.
Моча (средняя часть утренней порции или вся утренняя порция) собирается в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Анализ мочи на микобактерии должен предусматривать обязательное троекратное исследование. Особенностью существования M.Tuberculosis в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000 g всего материала, а не его донной фракции, получаемой после отстаивания в естественных условиях. Сбор суточной мочи для бактериологического исследования не практикуется.
При накоплении мочи в течение суток невозможно сохранить ее стерильность. Хранение емкости с мочой в холодном месте может привести к выпадению солей, что неблагоприятно отражается на последующей обработке осадка. Кроме того, в моче содержатся бактерицидные продукты (фенол), которые могут не только угнетать жизнеспособность микобактерий, но в течение суток даже разрушать микробные клетки. В то же время при длительном хранении мочи невозможно избежать размножения в ней гнилостной и гноеродной микрофлоры. Установлено, что при хранении мочи более 1 часа после ее сбора число микробных клеток неспецифической гноеродной и гнилостной микрофлоры увеличивается в несколько раз. Ферменты жизнедеятельности этой флоры могут угнетать способность микобактерий к росту. И наконец, следует иметь в виду возможность попадания в нее кислотоустойчивых сапрофитов, что может привести к диагностическим ошибкам. В лаборатории мочу центрифугируют, используя метод накопления осадка.
Чаще всего для диагностики туберкулеза исследуется мокрота больного. У больного с продуктивным кашлем получение мокроты не представляет трудностей. В случае, если больной не может откашлять мокроту, можно использовать другие методы.
Сбор мокроты для исследования на микобактерии туберкулеза – весьма ответственный этап диагностической процедуры, от четкости проведения которого во многом зависит результат исследования.
Необходимо иметь в виду, что в момент откашливания больным мокроты создается очень высокий риск воздушно-капельного распространения инфекции. В связи с этим желательно, чтобы сбор мокроты производился в специально выделенном для этих целей отдельном, хорошо вентилируемом помещении (пункте сбора мокроты), оснащенном бактерицидными лампами и средствами дезинфекции, или на открытом воздухе. Идеальным вариантом является установка в комнате для сбора мокроты специальной кабины для сбора мокроты с интенсивной вытяжной вентиляцией.
Сбор мокроты должен производиться в присутствии и при непосредственном участии медицинского работника. Лицам, ответственным за сбор мокроты, необходимо руководствоваться правилами.
Так, надо объяснить больному причины исследования и необходимость откашливать не слюну или носоглоточную слизь, а содержимое глубоких отделов дыхательных путей, что достигается в результате продуктивного кашля, возникающего после нескольких (2–3) глубоких вдохов. Необходимо также предупредить больного, что он должен предварительно прополоскать полость рта кипяченой водой, что позволяет механически удалить основную часть вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатки пищи, загрязняющие мокроту и затрудняющие ее обработку. Участвующий в сборе мокроты медицинский работник помимо халата и шапочки должен быть в маске-респираторе, резиновых перчатках и резиновом фартуке. Он должен находиться за спиной больного, выбирая свое положение таким образом, чтобы направление движения воздуха было от него – к больному.
Для сбора диагностического материала должны использоваться специальные контейнеры. Медицинский работник должен открыть контейнер для сбора мокроты, снять с него крышку и передать больному донную часть контейнера. Наилучшим вариантом является использование для сбора диагностического материала одноразовых пластиковых прозрачных контейнеров объемом около 50-100 мл. Контейнерыизготовлены из ударостойкого и прозрачного материала, не допускающего просачивания жидкости. Материал, из которого изготовлен такой контейнер, должен расплавляться (деформироваться) при автоклавировании (при 121 °С). Контейнеры должны легко подвергаться маркировке. Надежно сохранять мокроту на всем протяжении периода хранения, транспортировки и проведения исследования. Иметь завинчивающиеся крышки с уплотнением (исключить плотно закупоривающие флакон крышки: при открытии таких крышек в контейнере возникает разряженное пространство, которое приводит к образованию аэрозоля, создавая потенциальную опасность внутрилабораторного заражения). Контейнеры должны иметь широкое отверстие для сбора мокроты (не менее 30 мм в диаметре), чтобы пациент мог легко отделять мокроту внутрь контейнера, не подвергая загрязнению его наружную поверхность. Использование таких контейнеров позволяет легко оценить качество и объем собранного материала, а при приготовлении мазков из нативной мокроты – проводить выбор гнойных комочков для приготовления мазка непосредственно из контейнера, избегая чрезвычайно опасного из-за образования аэрозоля этапа выливания мокроты в чашку Петри.
По завершении процедуры сбора мокроты медицинский работник должен закрыть контейнер крышкой (или проверить, насколько плотно его закрыл пациент) и оценить количество и качество собранной мокроты.
Если мокроту получить не удалось, контейнер считается использованным и подлежит обеззараживанию.
Контейнер с порцией мокроты достаточного объема (не менее 3-5 мл), содержащей уплотненные или гнойные комочки без слюны, тщательно закрывают завинчивающейся крышкой, затем контейнер маркируют и помещают в специальный бикс для транспортировки в лабораторию.
В целях повышения высеваемости микобактерий время между сбором материала и обработкой должно быть минимальным. Материал сразу после сбора следует отправлять в лабораторию (в течение 24 часов). В случае удаленности лаборатории от места взятия материала его отправка в лабораторию может осуществляться два раза в неделю. В этом случае контейнеры с собранным материалом должны храниться в холодильнике при температуре 4–8 °С не более 72 часов. При хранении более 72 часов к диагностическому материалу добавляется консервант, в этом случае срок хранения увеличивается до 5 суток. Асептический материал должен отправляться в лабораторию немедленно!
В случаях других материалов, если предполагается их транспортировка при высокой температуре окружающей среды или их доставка в лабораторию более чем через 24–72 часа после сбора (взятия), рекомендуется использовать химические консерванты (если предполагаемая задержка не превышает 24 часа, материал смешивают с равным объемом 10% раствора трехзамещенного фосфата натрия). Для безопасной транспортировки патологический материал должен быть упакован в водонепроницаемую и небьющуюся емкость, защищенную от сотрясений, ударов и других возможных воздействий.
Подавляющее большинство материала, отправляемого в лабораторию, направляется в нее в единообразных контейнерах, применяемых для сбора мокроты, поэтому целесообразно иметь в лаборатории несколько специальных металлических или пластиковых транспортировочных ящиков. Они устроены таким образом, чтобы фиксировать 20–30 контейнеров с диагностическим материалом в вертикальном положении.
С каждым ящиком/биксом следует сопроводительный лист, в который из регистрационного журнала медицинского учреждения переносятся данные о пациентах. Направления и сопроводительный лист должны содержаться отдельно от материала (в полиэтиленовом пакете, вне бикса). Сопроводительный лист составляется в 2 экземплярах: один заполненный экземпляр оставляется в лаборатории; другой – с подписью сотрудника, принявшего материал для исследования, возвращается в учреждение, направившее материал в лабораторию. На втором экземпляре сопроводительного листа, который должен быть возвращен в ЛПУ отправителю, вписываются: наименование ЛПУ-получателя, фамилия и инициалы лица, принявшего материал и дата получения материала. Перед отправкой собранного материала медицинский работник должен проверить:
1) соответствует ли количество контейнеров с мокротой их количеству, указанному в сопроводительном списке;
2) соответствует ли номер каждого контейнера номеру, указанному в списке;
3) имеются ли в списке все необходимые данные о каждом пациенте.
После проверки в сопроводительном списке медработник:
1) указывает дату отправки материала на исследование и ставит свою подпись;
2) вкладывает в конверт сопроводительный список и заполненные бланки направлений на микроскопическое исследование на каждую пробу материала и прикрепляет конверт к биксу снаружи;
3) тщательно закрывает бикс.
Материал, поступающий в микробиологическую лабораторию, для культурального исследования с целью диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза, в различной степени загрязнен быстрорастущими бактериями, рост которых на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. В связи с этим перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию, то есть гибель гноеродной и гнилостной микрофлоры. Кроме того, микобактерии туберкулеза, выделяющиеся из дыхательных путей больного, как правило, окружены большим количеством слизистых веществ, затрудняющих их выделение. Поэтому мокроту и другие сходные материалы перед посевом одновременно с деконтаминацией подвергают разжижению и гомогенизации. Все препараты, используемые в настоящее время для разжижения и деконтаминации диагностического материала, обладают более или менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий.
80Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки материала, должны иметь степень очистки не менее категории «химически чистый» (ХЧ). Для предпосевной обработки диагностического материала рекомендуется использовать трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4), который хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2–3-дневном хранении материала при +4 °С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.
Для обработки мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр. используют серную кислоту. Микобактерии туберкулеза не теряют жизнеспособности в сильно закисленной среде, однако необходимо помнить, что длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты губительно действует на микобактерии. Поэтому кислотой производят обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры. Обработка кислотой не должна превышать 20 мин!
Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом образце материала. Данный показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов. Гидроокись натрия токсична по отношению, как к загрязняющим микроорганизмам, так и к микобактериям туберкулеза. Поэтому при использовании щелочи необходимо строго соблюдать время обработки. Общее время обработки материала щелочью не должно превышать 40 мин!
В клиниках с достаточными материальными ресурсами могут применяться более дорогие методы гомогенизации и деконтаминации, например, метод с использованием NALC-NaOН (N- ацетил-L-цистеина). Применение муколитического препарата NALC, используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет ускорить процесс деконтаминации и снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до 1%. NALK быстро теряет свою активность в растворенном виде, поэтому его раствор должен готовиться ежедневно и употребляться свежим. Иногда лабораторным работникам приходится сталкиваться с чрезмерно высокой контаминацией проб. Это создает большие сложности в работе. В таких случаях можно применить более жесткие методы деконтаминации с использованием 5% щавелевой кислоты или 4–6% серной кислоты. Эти методы нередко дают хорошие результаты в тех случаях, когда пробы мокроты оказываются массивно загрязненными Pseudomonas sp. и другими грамотрицательными микроорганизмами.
Спинномозговая, синовиальная и другие жидкости из закрытых полостей; костный мозг; гной из «холодных» абсцессов; резецированные ткани (за исключением материала аутопсии); пунктаты печени и лимфатических узлов, а также материалы биопсий (при отсутствии свища), если они были взяты в стерильные флаконы с соблюдением правил асептики, не нуждаются в деконтаминации.
Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить 3 основные группы:
- плотные питательные среды на яичной основе;
- плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе;
- жидкие синтетические и полусинтетические питательные среды (пробирки BBL MGIT с модифицированной средой Миддлбрука 7Н9; флаконы BACTEC 9000МВ Myco/F Lytic для посева крови; флаконы MB Blood-BacT Alert 3D для посевов крови).
Среды имеет свои преимущества и недостатки. Оптимальная среда для культивирования МБТ должна быть недорогой, простой в приготовлении, состоять из широко доступных компонентов. Кроме того, среда должна подавлять рост сопутствующей микрофлоры, обеспечивать хороший рост при засеве небольшого количества микобактерий и возможность предварительной дифференциации выросших колоний по морфологическим признакам. Яичные среды в наибольшей степени соответствуют вышеперечисленным требованиям при проведении посева из мокроты.
В результате многочисленных сравнительных испытаний установлено, что для культуральной диагностики туберкулеза следует использовать, как минимум, две разные по составу питательные среды. Наиболее широкое распространение получил набор из 2 яичных сред – Левенштейна-Йенсена и Финна-II.
Среда Левенштейна-Йенсена применяется во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Эта среда рекомендуется для использования во всех микробиологических лабораториях противотуберкулезной службы Российской Федерации для получения сравнимых результатов.
Среда Левенштейна-Йенсена – это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерий туберкулеза получают приблизительно на 18–25-й день после посева микроскопически положительного материала. В состав этой питательной среды входит глицерин, который способствует росту M. tuberculosis. Для выделения M. bovis рекомендуется вариант среды Левенштейна-Йенсена, в состав которой вместо глицерина входит 0,5% раствор пирувата натрия.
Среда Финна-II рекомендована в России как вторая стандартная среда для выделения микобактерий. Она отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что вместо L-аспарагина в ней используется глутаминовокислый натрий (глутамат натрия) и подбор солей рассчитан таким образом, что конечная кислотность среды имеет более низкое значение (рН = 6,3–6,5), чем кислотность среды Левенштейна-Йенсена (рН = 7,2–7,4), и большую стабильность. Эти свойства обуславливают более высокую эффективность среды при засеве материала, обработанного щелочными детергентами. Рост микобактерий появляется на этой среде на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена, а процент выделения культур на 6–8% выше.
В повседневной работе микробиологической лаборатории наряду с плотными питательными средами используются и жидкие. Наиболее широко распространенной и хорошо зарекомендовавшей себя в России жидкой питательной средой является среда Школьниковой.
Перед процедурой посева необходимо подготовить пробирки с питательными средами, пронумеровать их, согласно регистрационным номерам анализов, и последовательно расположить в вертикальном штативе. Аналогичным образом подготовить и пронумеровать предметные стекла.
Осадок, полученный после предварительной обработки диагностического материала одним из вышеуказанных методов, следует подвергнуть параллельному культуральному и микроскопическому исследованиям в следующем порядке:
1. Набрать стерильной мерной (предпочтительно одноразовой пластиковой) или пастеровской пипеткой 1,0–1,2 мл подготовленного осадка, оставив приблизительно 0,1–0,2 мл для последующего приготовления мазка для микроскопии. Соблюдая условия стерильности, внести равные объемы набранного материала (примерно по 0,5–0,6 мл) в 2 пробирки с разными плотными питательными средами. Пробирки с питательной средой при посеве должны находиться в наклонном положении (под углом 40–45°). Посевной материал нанести на верхнюю треть косяка питательной среды. Засеянные пробирки закрыть ватно-марлевыми пробками и поместить в вертикальном положении в штатив таким образом, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей поверхности косяка питательной среды.
2. На пронумерованное предметное стекло нанести 2–3 капли осадка для получения мазка для микроскопического исследования, распределив материал равномерным слоем в центре стекла на площади примерно 1–2 см. По завершении посева всех проб засеянные пробирки переместить в горизонтальные штативы и поместить в термостат при температуре 37 °С. При этом поверхность косяка питательной среды должна находиться в горизонтальной плоскости, а наклон штатива должен исключить смачивание пробки материалом засева.
3. Инкубация микобактерий туберкулеза требует длительного срока для получения видимого роста колоний. Длительный срок инкубации диктует необходимость соблюдения ряда правил для сохранения жизнеспособности клеток и ростовых свойств питательной среды. Температура инкубации: 37 °С. При первичном посеве микроскопически отрицательного материала средняя продолжительность роста микобактерий на плотных питательных средах может составить 20-46 дней. Рост отдельных штаммов появляется через 60 и даже более дней. Это обуславливает необходимость при отсутствии роста микобактерий для выдачи отрицательного результата выдерживать посевы в термостате до 10 недель. По истечении первых 2–3 суток инкубации ватно-марлевые или дренированные силиконовые пробки заменяют герметичными пробками (силиконовыми или резиновыми);
3. Пробирки переводят в вертикальное положение; инкубацию проводят в течение 10 недель при обязательном еженедельном про-
смотре засеянных пробирок.
Вирулентные культуры микобактерий туберкулеза обычно растут на плотных питательных средах в виде R-колоний различной величины и вида, имеют желтоватый или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту. Колонии, как правило, сухие, морщинистые, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или некоторых нетуберкулезных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. На среде Финна колонии часто выглядят более влажными, чем на среде Левенштейна-Йенсена. После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы). При приготовлении мазков для микроскопического исследования колонии микобактерий туберкулеза проявляют свои физико-химические особенности. Они не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию.
При микроскопическом исследовании мазков из выросших колоний, окрашенных по Цилю-Нильсену, обнаруживаются яркие малиново-красные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами.При культивировании на жидких средах или в условиях повышенной влажности M. Tuberculosis образуют скопления или переплетения в виде войлока или кос-феномен «корд-фактора». Микобактерии туберкулеза выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1–10 (чаще 1–4) мкм, шириной 0,2–0,6 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закругленными концами.
Часто в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно-окрашенных зерен. В молодых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулезными препаратами, микобактерии отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм.
Если морфология колоний или микобактерий вызывает сомнения в их принадлежности к роду Mycobacterium или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают 3% солянокислым спиртом в течение 40–45 минут. Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут сравнительно легко обесцвечиваться спиртом, так как они обладают слабой кислотоустойчивостью. В таких случаях культуры следует выдержать в термостате еще 5–10 дней и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их тинкториальных свойствах. Нетуберкулезные и авирулентные сапрофитные микобактерии могут варьировать по форме колоний и морфологии клеток. Колонии кремового цвета М. fortuitum, M. chelonae, М. kansasii и М. terrae complex бывают сухие и морщинистые, поэтому их иногда ошибочно принимают за МБТ. Окраска колоний НТМБ может быть от белого, телесного и кремового цвета до слабо-желтого, желтого и оранжевого. Рост культуры НТМБ может быть пышным или стелющимся, выпотевающим – дисгоническим. Некоторые из них грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены, и они редко образуют жгутообразные скопления (корд-фактор, как правило, отсутствует). Однако некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в виде характерной для микобактерий туберкулеза R-форме. Многие нетуберкулезные и сапрофитные микобактерии имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные по морфологии с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза. Группа родственных микроорганизмов (нокардии, родококки и др.) отличается частичной или слабой кислотоустойчивостью. В мазке можно одновременно встретить красные и синие палочки или фиолетово-синие коккобациллы. Морфологически в мазке из культуры они представлены в виде мицелия, фрагментирующегося на палочки, или крупных полиморфных палочек (таблица). Для дифференциации рода микобактерий и родственных таксонов кроме вышеописанного теста дополнительно можно использовать окраску мазка по методу Грама. Нокардии, родококки и коринебактерии хорошо воспринимают окраску по Граму – грамположительные. На основании тинкториально-морфологических свойств и скорости роста проводится определение рода выделенной культуры. У родственных микроорганизмов отмечается слабая или частичная кислотоустойчивость, быстрый рост на простых и яичных средах, выраженная окраска по методу Грама и значительный полиморфизм при микроскопическом исследовании мазка. Нокардии и родококки не имеют важного клинического значения и могут изучаться в научных лабораториях.
4. Окончательное заключение о принадлежности выделенной культуры к комплексу M. tuberculosisможно сделать только после проведения первичной дифференциации культуры, выполняемой в ходе постановки теста на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза. При необходимости проводится дальнейшая идентификация выделенной культуры, позволяющая отнести микобактерии к тому или иному виду.
При оценке результатов культурального исследования диагностического материала необходимо соблюдать следующие правила.
1. Наблюдение за посевами и просмотр засеянных пробирок следует проводить еженедельно.
2. При отсутствии роста посевы должны выдерживаться в термостате в течение 10 недель. Отрицательный результат культурального исследования может быть выдан только по истечении этого срока инкубации.
3. Во время очередного просмотра следует отбирать все пробирки, в которых имеется рост колоний, расставляя их по порядку номеров регистрации материала.
4. При оценке результатов регистрировать следующие параметры:
- «появление роста» – дату появления роста в пробирках (в том случае, если рост появляется одновременно в обеих пробирках). Если культура выросла только в одной из пробирок (при этом имеется хороший рост культуры в соответствующие сроки), а во второй рост отсутствует, рекомендуется зарегистрировать дату появления роста и показатель роста в пробирке с выросшей культурой и использовать ее для дальнейшей работы, не дожидаясь появления роста колоний в другой пробирке. Вторую пробирку оставляют в термостате для дальнейшей инкубации и при наличии в ней роста в дальнейшем регистрируют полученные результаты;
- «интенсивность роста» – число колоний, выросших в каждой из пробирок. При наличии одновременного роста во всех пробирках рекомендуется оценить суммарное число колониеобразующих единиц (КОЕ) во всех пробирках, засеянных данным материалом. Этот показатель имеет важное диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике наблюдения за больным в процессе химиотерапии;
- «загрязнение посева» посторонней микрофлорой или грибами («пророст»), при наличии такового;
- «отсутствие роста» (указанный параметр регистрируется через 10 недель культивирования).
Соблюдение указанных правил позволяет, своевременно осуществлять первичную идентификацию микобактерий. При этом необходимо иметь в виду следующие показатели:
- появление роста кислотоустойчивых микобактерий в течение 7–10 дней культивирования на плотных питательных средах может свидетельствовать о выделении быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий, которые не относятся к комплексу M. tuberculosis. Поэтому перед выдачей ответа такие культуры должны подвергнуться первичной идентификации.
- появление роста кислотоустойчивых микобактерий после 3–4 недель культивирования свидетельствует о выделении M. tuberculosis, а также других медленнорастущих микобактерий, которые могут относиться к потенциально патогенным нетуберкулезным микобактериям или к безвредным кислотоустойчивым сапрофитам. Прежде чем дать отрицательный ответ после 10 недель культивирования, необходимо убедиться в отсутствии роста очень медленно растущих микобактерий, в числе которых могут быть и M. tuberculosis.
В ряде случаев некоторые микроорганизмы, загрязняющие посевы, обладают способностью разлагать составные ингредиенты среды с образованием кислоты. Это приводит к снижению pH-среды. На такой среде микобактерии не растут, и такие пробирки подлежат удалению. Посевы с частичным загрязнением желательно выдержать до окончания срока инкубации или до развития хотя бы нескольких колоний микобактерий, так как позднее появление загрязнения не исключает роста M. tuberculosis. В таких случаях необходимо сделать мазок, окрасить его по методу Циля-Нильсена и при наличии кислотоустойчивых микобактерий попытаться обработать выросшую культуру 3–4% раствором серной кислоты, а после отмывания ее изотоническим раствором хлористого натрия вновь засеять осадок на питательные среды.
Родовая идентификация микобактерий и первичная идентификация комплекса M. tuberculosis должны проводитьсяв бактериологических лабораториях на основании скорости роста бактерий, морфологии и окраски колоний, результатов исследования мазков, приготовленных из выделенной культуры и окрашенных по Цилю-Нильсену. Делается заключение о принадлежности культуры к комплексу микобактерий туберкулеза (МБТ). Главной отличительной особенностью рода микобактерий является строгая кислото-, щелоче- и спиртоустойчивость. Характеристика микобактерий и родственных таксонов представлена в таблице 21.,
Таблица 21