Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
Аспартатаминотрансфераза (АсАТ, КФ: 2.6.1.1) и аланинаминотрансфераза (АлАТ, КФ: 2.6.1.2) – пиридоксальфосфатсодержащие ферменты.
АсАТ катализирует обратимый перенос аминогруппы от аспартата на a-кетоглутарат с образованием глутамата и оксалоацетата.
АлАТ катализирует обратимую реакцию переноса аминогруппы от аланина на a-кетоглутарат с образованием глутамата и пирувата (ПВК).
АлАТ содержится в цитозоле, тогда как для АсАТ известны 2 формы: цитоплазматическая и митохондриальная.
При поражении тканей аминотрансферазы «вымываются» из поврежденных клеток в кровоток, поэтому определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение, особенно для диагностики поражений сердца и дифференциальной диагностики болезней печени. Так, при неосложненном инфаркте миокарда, уровень АсАТ в сыворотке крови начинает повышаться уже через 4-6 часов после наступления инфаркта, максимум активности приходится на вторые сутки и лишь на 5-8 день активность фермента снижается до нормы. Изменение активности сывороточной АлАТ при этом незначительно.
При инфекционном гепатите (болезни Боткина) и обострении хронического гепатита активности обеих аминотрансфераз в сыворотке крови повышаются (активность АлАТ повышается сильнее). Цирроз печени не сопровождается значительной гиперферментемией.
Цель работы
Определить активности обеих аминотрансфераз в сыворотке крови колориметрическим методом и сравнить полученные результаты с нормой.
Принцип метода
Определение активности обеих аминотрансфераз основано на колориметрическом обнаружении пирувата, образующегося за 1 час инкубации, по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде. В случае АлАТ пируват образуется непосредственно из аланина, а в случае АсАТ пируват образуется из оксалоацетата после декарбоксилирования последнего в щелочной среде:
Аспартат + a-Кетоглутарат 
Глутамат + Оксалоацетат
 |
Пируват CO2
Активности обоих ферментов определяют по калибровочному графику.
Выполнение работы[‡‡] (см. приложение )
| Реагенты, этапы | Опыт | Контроль |
| Субстрат для АсАТ или АлАТ, мл | 0,25 | 0,25 |
| Физиологический раствор, мл | — | 0,05 |
| Сыворотка крови, мл | 0,05 | — |
| Инкубируют 60 минут при 37 °С | ||
| 2,4-Динитрофенилгидразин, мл | 0,25 | 0,25 |
| Перемешивают и оставляют на 20 минут при 20 °С | ||
| Раствор NaOH , мл | 2,5 | 2,5 |
| Через 10 мин фотометрируют против Н2О (l = 500 нм, толщина кюветы 0,5 см) D540 | ||
| Dоп – Dк |
Расчет активности производят в мккат/л по калибровочному графику:
| Активность АлАТ или АсАТ в мккат/л | Dоп – Dк |
| 0,1 | 0,025 |
| 0,2 | 0,05 |
| 0,3 | 0,08 |
| 0,4 | 0,11 |
Норма: АлАТ = 0,05 – 0,12 мккат/л; АсАТ = 0,06 – 0,14 мккат/л. Верхний предел – 0,42 мккат/л.
Выводы
Тестовые задания по теме: «Обмен аминокислот»
1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»
1. Тирозин является незаменимой аминокислотой для человека.
2. В окислительном дезаминировании аминокислот могут участвовать разные коферменты.
3. Реакции трансаминирования аминокислот необратимы.
4. В процессах трансдезаминирования и трансреаминирования аминокислот участвует α-кетоглутаровая кислота.
5. Коферентом аминотрансфераз служит ФАД.
6. В процессе трансаминирования выделяется аммиак.
7. Возможно ли превращение пировиноградной кислоты в аланин в организме человека?
8. Является ли фенилаланин предшественником серотонина?
9. Используют ли определение активности аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови человека для диагностики инфаркта миокарда?
10. Нужен ли витамин В1 для реакций трансаминирования?
11. Усиливается ли глюконеогенез при сахарном диабете?
12. Участвуют ли лизин и треонин в реакциях трансаминирования?
2) Выбрать один правильный ответ
| Метаболит ЦТК, участвующий в реакциях трансаминирования: 1. цитрат 2. изоцитрат 3. сукцинат 4. фумарат 5. оксалоацетат | Гликогенной аминокислотой не является: 1. аргинин 2. глутамин 3. гистидин 4. лейцин 5. метионин |
3) Установить соответствие названия вещества и его предшественника