Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге

ЧЕЛЯБИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

III СЕМЕСТР

Методическое пособие для студентов

ФАКУЛЬТЕТ_____________________________

сТУДЕНТ_____________________________

ГРУППА_____________________________

ПРЕПОДАВАТЕЛЬ_____________________________

2007-2008

ЧЕЛЯБИНСК

2007-2008

нАСТОЯЩЕЕ УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ СОЗДАНО КОЛЛЕКТИВОМ КАФЕДРЫ БИОХИМИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ. сОЗДАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ПОСОБИЯ БЫЛО ВЫЗВАНО НЕОБХОДИМОСТЬЮ - ПОМОЧЬ СТУДЕНТАМ В ОСВОЕНИИ СЛОЖНОГО ТЕОРЕТИЧЕСКОГО ПРЕДМЕТА - БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ.

в РАБОЧУЮ ТЕТРАДЬ ВНЕСЕНЫ ТЕМЫ ВСЕХ ЗАНЯТИЙ iii СЕМЕСТРА, ВНЕСЕНЫ ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ, ЧТО ЗНаЧИТЕЛЬНО ДОЛЖНО ОБЛЕГЧИТЬ ПОДГОТОВКУ СТУДЕНТА К ЗАНЯТИЮ. сТУДЕНТ СМОЖЕТ ПОЗНАКОМИТЬСЯ ЗАРАНЕЕ С ТОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТОЙ, КОТОРУЮ ЕМУ ПРЕДСТОИТ ВЫПОЛНИТЬ. в НЕЙ СФОРМУЛИРОВАН ПРИНЦИП МЕТОДА, ЧТО ПОМОЖЕТ СТУДЕНТУ НЕ ПРОСТО ВЫПОЛНИТЬ РАБОТУ, НО И ОСМЫСЛИТЬ ее.

кАЖДОЕ ЗАНЯТИЕ ИМЕЕТ ПРИЛОЖЕНИЕ ЛИБО ОБЩЕЕ ДЛЯ ВСЕХ ФАКУЛЬТЕТОВ, ЛИБО ДЛЯ каждого факультета, ЧТО ЗНАЧИТЕЛЬНО ЭКОНОМИТ ВРЕМЯ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ НА ЗАНЯТИИ, ДАВАЯ ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ РАССМОТРЕНИЯ И ЗАКРЕПЛЕНИЯ МАТЕРИАЛА.

сТУДЕНТ МОЖЕТ САМОСТОЯТЕЛЬНО ПРОВЕРИТЬ КАЧЕСТВО СВОЕЙ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ, РЕШИВ СИТУАЦИОННЫЕ ИЛИ ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ. нЕВОЗМОЖНОСТЬ ОТВЕТА НА ВОПРОСЫ ДОМАШНИХ ЗАДАНИЙ ДОЛЖНО НАСТОРОЖИТЬ СТУДЕНТА О НЕКАЧЕСТВЕННОЙ ПОДГОТОВКЕ МАТЕРИАЛА ПО ДАННЫМ ВОПРОСАМ.

жЕЛАЕМ УСПЕХА В ИЗУЧЕНИИ ПРЕДМЕТА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ!

Составители:

Цытович А.Л.

Соломатова Т.В.

Маляр К.В.

Чарная Л.Ф.

Крупицкая Л.И.

Горностаева А.Б.

Синицкий А.и. под ред. зав каф. Проф. Цейликмана В.Э.

Занятие 1

Химический состав и строение простых белков

Цель занятия. Освоить некоторые методы выделения белков из мышечной ткани.

Проанализировать аминокислотный состав выделенных из мышечной ткани белков, используя цветные реакции на белки и аминокислоты.

Вопросы для самоподготовки

1. Белки: элементный и аминокислотный состав. Физиологическая роль белков.

2. Гидролиз белков (кислотный, щелочной, ферментативный, полный и частичный).

3. Качественное обнаружение белков с помощью цветных реакций (биуретовой, нингидриновой).

4. Хроматографические методы изучения аминокислотного состава гидролизатов белков.

Практическая часть занятия

Биуретовая реакция

Принцип метода: реакция основана на том, что в щелочной среде в присутствиеи солей меди белки дают фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием комплекса ионов меди с пептидной группировкой. Реакция позволяет обнаружить наличие пептидной связи в исследуемом веществе, и является универсальной реакцией для обнаружения веществ белковой природы.

Ход работы: в пробирку наливают 1-2 мл раствора белка, добавляют 1-2 мл 10% раствора NaОН и 1-2 капли 1% раствора CuSO₄.

Результат:

Вывод:

Нингидриновая рекция

Принцип метода: основан на том, при нагревании с a-аминокислотами, а также полипептидами нингидрин образует фиолетово-розоватое окрашивание. При нагревании с нингидрином аминокислоты подвергаются окислительному дезаминированию идекарбоксилированию, при этом выделяется углекислый газ, аммиак, образуется альдегид, восстановленный нингидрин конденсирует с аммиаком и окисленным нингидрином, образуя окрашенное соединение.

Ход работы: к 0,5 мл раствора белка добавить 5 капель 0,2 % водного раствора нингидрина и прокипятить 2-3 минуты.

Результат:

Вывод:

Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге

Определение содержания отдельных амнокислот методом хроматографии на бумаге важно для изучения обмена белков и аминокислот в организме. С помощью бумажной хроматографии можно легко провести разделение аминокислот, содержащихся в гидролизате различных белков, сыворотке крови, моче и т.д.

Принцип метода. Основан на том, что различные растворители (Н-бутанол СН₃СООН; фенол, насыщенный водой и др.), смачивая хроматографическую бумагу, создают на ней две фазы: неподвижную водную фазу и подвижную фазу органического растворителя. Неподвижная водная фаза образуется в силу значительной гигроскопичности бумаги, т.е. свойства задерживать определенное количество влаги на поверхности волокон целлюлозы. Органический растворитель, двигаясь по бумаге, увлекает за собой аминокислоты, которые перемещаются с различной скоростью. Она зависит от способности аминокислот растворяться в органическом растворителе (или воде). От избирательной адсорбции, от окружающей температуры, сорта бумаги, растворителя и ряда других факторов.

Хроматографию проводят в герметических камерах, насыщенных парами растворителя.

Для проведения восходящей хроматографии на нижний конец хроматографической бумаги наносят определенный объем исследуемого раствора, высушивают, нижний край бумаги помещают в растворитель и бумагу закрепляют в этом положении. Камеру закрывают. Растворитель поднимается по бумаге и увлекает за собой аминокислоты. При этом происходит разделение аминокислот из смеси. После того, как фронт растворителя по бумаге достигнет определенного уровня, бумагу вынимают из камеры, высушивают, а аминокислоты проявляют с помощью нингидрина.

Скорость передвижения аминокислот на бумаге характеризуется коэффициентом распределения Rf. Это отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (А) к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя (Б) А

Rf.= ----

Rf. является величиной, характерной для каждой аминокислоты, и постоянен при данных условиях опыта.

Ход работы. На конце полоски фильтровальной бумаги размером 1х15см сделать прокол иглой, продеть нитку, завязать петлю. На противоположном конце простым карандашм, отступив от края на 1 см, нанести кружок, в который наносят смесь аминокислот.

На дно пробирки, не задевая стенок, поместить 1,5 мл растворителя. Придерживая за нитку, опустить бумажку до соприкосновения ее нижнего краяс ратворителем и закрыть пробирку, чтобы бумажка висела на нитке, касаясь нижним краем растворителя. Через час бумагу вынимают, просушивают, смачивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, снова просушивают, и помещают в термостат на 15 минут при температуре 55°С в темноте. Отмечают появление фиолетовых пятен. Проводят расчет для каждой аминокислоты.

Результат.

Вывод.

Домашнее задание:

1. Повторить классификацию и строение аминокислот (знать формулы)

2. Повторить типы связей в молекулах белка, стабилизирующих первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры.

3. Знать образование ди-, три- и полипептидов и их название.

4. Повторить методы изучения аминокислотного состава белков с помощью цветных реакций и хроматографии.

Литература:

1. Лекции по курсу биологической химии

2. Северин Е.С. Биохимия . М. 2003

3. Николаев А.Я. Биологическая химия. 2001

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 1998

5. Строев Е.А.Биологическая химия. 1986

6. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В.. Биохимия. М. 2000

7. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. М. 2001

СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Страйер Л. Биохимия М. Мир. 1984

2. Уайт А., Хенглер Ф. Смит Э. и др. Основы биохимии, М. 1981

3. Марри Р. Греннер Д. Биохимия человека, 1993

Занятие 2