Реакции осаждения белков при комнатной температуре нейтральными солями — высаливание
Принцип метода:Высаливанием называют осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: хлористого натрия, сернокислого аммония и др. Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуются неодинаковые концентрации одних и тех же солей. Глобулины осаждаются в полунасыщенном растворе сернокислого аммония, а альбумины — в насыщенном растворе этой же соли. Высаливание белков является обратимой реакцией, так как осадок белка может вновь растворяться после уменьшения концентрации солей диализом или разведением водой.
При высаливании белок обычно почти не теряет своих естественных свойств, он может, например, вновь проявлять ферментативную активность. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и разделить фракции при получении гормональных и ферментных препаратов.
Реактивы: раствор яичного белка для высаливания с хлористым натрием (белок 3-х куриных яиц смешивают с 700 мл дистиллированной воды и с 300 мл насыщенного раствора хлористого натрия и фильтруют через несколько слоев марли); хлористый натрий, кристаллический в виде тонко измельченного порошка; сернокислый аммоний, насыщенный раствор; сернокислый аммоний, кристаллический, тонко измельченный порошок; уксусная кислота, 1% раствор; едкий натр, 10% раствор; сернокислая медь, 1% раствор.
Ход работы:
1. Высаливание белков хлористым натрием.
В пробирку наливают 20 капель раствора белка и прибавляют тонко измельченного порошка хлористого натрия до полного насыщения раствора. Через несколько минут появляется осадок глобулинов. Содержимое пробирки отфильтровывают. В фильтре остается альбумин. Затем к фильтрату прибавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и кипятят; в слабокислой среде альбумин выпадает в осадок. Через несколько минут альбумин отфильтровывают и проверяют фильтрат на отсутствие белка при помощи биуретовой реакции.
2. Высаливание белков сернокислым аммонием.
К 15 каплям раствора белка добавляют 15 капель насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония, в котором выпадает осадок глобулинов. Через 5 минут отфильтровывают содержимое пробирки. В фильтрате остается другой белок – альбумин. К фильтрату добавляют тонко измельченный порошок сернокислого аммония до полного насыщения. Выпадает осадок яичного альбумина. Альбумин отфильтровывают. Проверяют фильтрат на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.
Указания к составлению отчета. Отметить положительный результат осаждения белков плюсом, а отрицательный — минусом и результаты работы занести в таблицу.
Осаждение белков высаливанием.
| применяемый р-р белка и название белковых фракций | что осаждается в насыщенном растворе NаС1? | что осаждается в слабокислой среде при кипячении после высаливания NаС1? | что осаждается в полунасыщенном растворе (NH4)2SO4? | что осаждается в насыщенном растворе (NH4)2SO4? |
Диализ белка.
Принцип метода:Удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей, например, избытка солей после высаливания, является диализ. Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и др.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.
Реактивы: раствор яичного белка; NaCl, насыщенный раствор; АgNO3; NаОН, 10% раствор; СuSO4, 1% раствор.
Ход работы:В стаканчик на 100 мл наливают 30 мл дистиллированной воды и опускают трубку для диализа, в которую предварительно был налит раствор белка куриного яйца (2мл) и добавлено 3 капли NaCl насыщенного раствора. По истечении 5-10 минут берут воду из стаканчика на анализ: проводят биуретовую реакцию на обнаружение белка и качественную реакцию на присутствие хлоридов с помощью AgNO3.
Примечание: раствор белка в трубке для диализа по уровню должен быть ниже жидкости в стакане.
