Исходный уровень знаний и навыков. 1 Теоретические основы химической кинетики
Студент должен знать:
1 Теоретические основы химической кинетики.
2 Строение моносахаридов. Качественные реакции на альдегидные и спиртовые группы.
3 Строение полисахаридов. Свойство и качественные реакции.
4 Механизм образования шиффовых оснований.
5 Строение и механизм катализа коферментами NAD+ и NADP+.
Студент должен уметь:
1 Проводить качественные реакции на продукты ферментативного гидролиза.
Структура занятия
Теоретическая часть
1.1 Свойства ферментов (термолабильность, специфичность и др.). Механизм действия ферментов. Этапы взаимодействия фермента и субстрата. Гипотезы Э. Фишера, Д. Кошланда и современные взгляды.
1.2 Теория промежуточных соединений. Основы термодинамики катализа. Энергия активации. Энергетический барьер.
1.3 Кинетика ферментативных реакций (факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций: природа фермента и субстрата, их концентрация, pH, температура, лекарственные препараты и др.). Km – определение, физиологическое значение.
1.4 Регуляция активности ферментов. Роль гормонов, цАМФ, активаторов, ингибиторов. Регуляция активности путем химической модификации ферментов (ограниченный протеолиз, фосфорилирование, метилирование и др.). Виды ингибирования. Аллостерическая регуляция и свойства аллостерических ферментов.
Практическая часть
2.1 Решение задач и проведение контроля конечного уровня знаний.
2.2 Лабораторные работы.
Задачи
1 Аскорбиновая кислота необходима для синтеза ифункционирования коллагена и потребляется в реакциях, катализируемых: а) лизил-гидроксилазой; б) лизил-оксидазой; в) пролил-гидроксилазой; г) АСТ?
2 Каталитическое действие ферментов связано:
а) с увеличением энергии активации;
б) уменьшением энергии активации;
в) увеличением свободной энергии реакции;
г) уменьшением свободной энергии реакции?
3 Какие ферменты активируются из зимогенов: а) карбоксипептидаза; б) химотрипсин; в) пепсин; г) трипсин; д) ЛДГ; е) АСТ?
4 В катализируемой реакции фермент:
а) увеличивает скорость реакции в обоих направлениях;
б) смещает равновесие по направлению к продукту реакции;
в) снижает энергию активации;
г) уменьшает значение свободной энергии;
д) изменяет константу Михаэлиса?
Лабораторные работы
Лаборатоpная работа № 1.Изучение действия ферментов
Действие липазы.
Липаза входит в состав сока поджелудочной железы. В желудочном соке она содержится в небольшом количестве и действует только на предварительно эмульгированные жиры. В кишечнике желчные кислоты и белки способствуют эмульгированию липидов. Действие липазы можно обнаружить, добавив ее раствор к молоку, предварительно слабо подщелоченному раствором карбоната натрия в присутствии фенолфталеина, дающего бледно-розовую окраску.
Принцип метода. Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира на глицерин и жирные кислоты (см. уравнение), что приводит к снижению pH и исчезновению розовой окраски индикатора – фенолфталеина.
Ход работы. В две пробирки наливают по 10 капель молока. В 1-ю пробирку добавляют 5 капель панкреатина, содержащего липазу, во 2-ю – 5 капель воды. В обе пробирки наливают по 1 капле 0,5 %-го раствора фенолфталеина и по каплям 1 %-го раствора карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски при pH 8,0 (нельзя приливать избыток раствора карбоната натрия). Пробирки помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. Наблюдают обесцвечивание раствора в пробирке, содержащей липазу.
Выводы по результатам работы.
Действие уреазы.
Принцип метода. Уреаза катализирует гидролиз мочевины на двуокись углерода и аммиак (см. уравнение), что приводит к увеличению pH, которое регистрируется индикатором – фенолфталеином.
Ход работы. Берут две пробирки. В 1-ю отмеривают 1мл 1 %-го раствора мочевины, а во 2-ю ‑ 1мл 1 %-го раствора тиомочевины. В каждую пробирку добавляют по 2 капли фенолфталеина и по 1 мл раствора уреазы. Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают за появлением розовой окраски в пробирке с мочевиной и отсутствием окраски в пробирке с тиомочевиной. Содержимое 1-й пробирки приобретает розовую окраску вследствие смещения pH раствора в щелочную сторону за счет образования аммиака.
Выводы по результатам работы.
Лаборатоpная работа № 2.Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций (УИРС).
Скорость ферментативных реакций зависит от многих факторов: концентрации субстрата и фермента, pH среды, наличия активаторов и ингибиторов, коферментов и концентрации ионов в реакционной среде.
Фермент a-амилаза содержится в слюне и катализируетгидролиз a(1-4) гликозидной связи крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы. Кроме того, в слюне имеется фермент мальтаза, расщепляющий мальтозу до глюкозы. Гидролиз крахмала под действием a-амилазы происходит до стадии образования декстринов. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины в зависимости от размера дают с йодом синее окрашивание, амилодекстрины – фиолетовое, эритродекстрины – красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза – желтое. Конечные продукты гидролиза крахмала – мальтоза и глюкоза имеют свободные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно-восстановительная реакция. При этом альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь – в гидрат окиси меди желтого цвета. При дальнейшем нагревании гидрат закиси меди переходит в красную закись меди.
Одним из характерных свойств ферментов является термолабильность, т. е. чувствительность фермента к температуре, прикоторой протекает ферментативная реакция. Для многих ферментов температурный оптимум составляет 38–40 °С.
При нагревании выше 70 °C вследствие тепловой денатурации белковой молекулы ферменты утрачивают свои свойства. Степень инактивации зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного процесса резко снижается. В термолабильности ферментов можно легко убедиться на примере действия амилазы слюны. О действии фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции.
Реакция Троммера.
ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с гидроксидом натрия и нагреванием.
Ход работы. К 5 каплям неразведенной слюны прибавляют 3 капли крахмала, 5 капель 10 %-го раствора едкого натра и 3 капли 1 %-го раствора сульфата меди. Дают постоять при комнатной температуре 15 мин. Затем осторожно нагревают до закипания. Появление красного окрашивания указывает на положительную реакцию Троммера.
Выводы по результатам работы.
Влияние температуры на активность амилазы.
Расщепление крахмала амилазой можно наблюдать, используя реакцию с йодом.
ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с кипящей водяной баней.
Ход работы.
1 Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл раствора крахмала. Еще в 4 пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1 : 10) слюны.
2 Берут первую пару пробирок (одна – с ферментом, другая – с крахмалом) и помещают на баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару помещают в термостат (40 °C), а четвертую – в кипящую водяную баню.
3 Через 10 минсодержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 мин в тех же условиях.
4 Из 3-й пробирки отбирают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин, и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Затем добавляют 2 капли раствора йода во все пробирки и наблюдают за появлением окрашивания.
Выводы по результатам работы.
Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.
Ход работы.
1 В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, а во 2-ю – 8 капель воды и 2 капли 1 %-го раствора хлорида натрия, в 3-ю – 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди.
2 В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной слюны (1 : 10), пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.
3 Тем временем готовят 3 пробирки с водой (по 1 мл), подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В 1-й пробирке появляется фиолетовая или красно-бурая окраска, во 2-й пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в 3-й, где ионы меди тормозят действие амилазы, – окраска остается синей. Если описанная картина не наблюдается, то опыт повторяют через 10–15 мин.
Выводы по результатам работы.
Влияние pH на активность амилазы слюны.
Оптимум pH для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях pH среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с йодом в течение времени. При оптимальном значении pH расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки pH в кислую или щелочную сторону произойдет лишь частичное расщепление крахмала до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).
Ход работы.
1 В 4 пронумерованные пробирки отмеривают отдельными пипетками по 2 мл фосфатного буфера с различным значением pH (6,0; 6;4, 6,8; 7,4).
2 В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл разбавленной (1 : 10) слюны, которые помещают в термостат на 10 мин при 38 °С.
3 Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин до тех пор, пока проба из 5-й пробирки даст с йодом на стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода (начинать с 1-й пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают. Сравнивают между собой окрашивание во всех пробирках и делают вывод о степени расщепления крахмала, а следовательно, об активности фермента при этом значении pH среды.
Выводы по результатам работы.
Рекомендуемая литература
Основная
1 Материал лекций.
2 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 105–123; 1998. С. 143–156.
3 Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 52–92.
Дополнительная
4 Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 76–110.
5 Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 100–111.
6 Ленинджер А. Л. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 226–302.
7 Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.
Занятие 4
Номенклатура и классификация ферментов. Медицинская энзимология
Цель занятия: сформировать представления о принципах номенклатуры и классификации ферментов, основных аспектах и проблемах медицинской энзимологии. Научиться определять активность амилазы в моче.