Исходный уровень знаний и навыков. 1 Понятие об электродвижущей силе окислительно-восстановительных реакций
Студент должен знать:
1 Понятие об электродвижущей силе окислительно-восстановительных реакций.
2 Строение NAD+, NADP+, FAD, FMN, кофермента Q, цитохромов и их роль в окислительно-восстановительных процессах.
3 Электронное строение атома кислорода и его активных форм; каталаза, пероксидаза.
4 Сущность свободнорадикальных процессов.
Студент должен уметь:
1 Проводить титрационный анализ.
Структура занятия
Теоретическая часть
1.1 Пути утилизации кислорода в организме (митохондриальное, микросомальное и перекисное окисление).
1.2 Структура и функция дыхательной цепи (ДЦ) митохондрий. Комплексы ДЦ. Основные принципы и механизм функционирования ДЦ митохондрий. Ферменты тканевого дыхания: NAD+, NADP+, FAD ‑ зависимые дегидрогеназы, убихинон, цитохромы, их строение и роль.
1.3 Окислительное фосфорилирование (ОФ). Пункты фосфорилирования. Коэффициент P/О ‑ показатель степени сопряжения ОФ. Механизмы сопряжения окисления и фосфорилирования. Хемиосмотическая теория сопряжения окислительного фосфорилирования П. Митчелла. Разобщение окисления и фосфорилирования. Разобщители. Механизм действия разобщителей. Биологическое значение разобщения ОФ.
1.4 Значение тканевого дыхания в биоэнергетике клетки и организма. Энергетический баланс одного оборота ЦТК.
1.5 Микросомальное окисление. Понятие о микросомах. Характеристика ЭПС. Микросомальная ДЦ. Основные переносчики: NAD+, NADP+, FAD и FMN ‑ зависимые дегидрогеназы, цитохромы b5, P450, их функции. Субстраты и косубстраты микросомального окисления (метаболизм ксенобиотиков).
1.6 Сходство и отличие микросомальной и митохондриальной ДЦ. Связь ЦТК, ДЦ митохондрии с микросомальной ДЦ. Биологическое значение и органное распределение микросомального окисления.
1.7 Понятие о перекисных процессах. Электронное строение атома кислорода. Механизмы образования активных форм кислорода. Перекисное окисление в норме и при патологии. Антиоксидантная защита: ферментная (СОД, каталаза, пероксидаза и др.) и неферментная (глутатион, витамины А, С, Е, метаболиты, и др.).
1.8 Витамины A, C, E их строение и роль в обмене.
Практическая часть
2.1 Решение задач.
2.2 Лабораторная работа.
2.3 Проведение контроля конечного уровня знаний.
Задачи
1 При прохождении электронов от сукцината черезДЦ к кислороду верными условиями являются:
а) отношение P/O = 2; б) участвует коэнзим Q; в) участвует цитохром Р450; г) участвует NADH-дегидрогеназа; д) отношение P/O = 1?
2 Что не принимает участия в транспорте электронов по митохондриальной ДЦ:
а) NADH; б) цитохром P450; в) негемовое железо; г) цитохром b; д) флавопротеид; е) цитохром b5?
3 При окислении 1 грамма какого из субстратов выделяется больше АТФ:
а) изоцитрата; б) аспартата; в) олеиновой кислота; г) фруктозы; д) гликогена; е) сукцината?
4 При окислительном фосфорилировании динитрофенол является:
а) ингибитором NAD+-потребляемых реакций;
б) ингибитором цитохромов;
в) ингибитором синтеза АТФ и дыхания;
г) разобщителем;
д) ингибитором SH-групп;
е) переносчиком протонов (протонофором)?
5 Какие из указанных фосфатных соединений имеют более отрицательное значение DG° при гидролизе, чем ГТФ:
а) Г-1-Ф; б) Г-6-Ф; в) 2,3-дифосфоглицерат; г) фосфоенолпируват; д) глицерол-1-фосфат?
6 Цитохромоксидаза содержит:
а) кобальт; б) цинк; в) магний; г) ванадий; д) медь; е) селен?
7 Цитохромоксидаза специфически ингибируется:
а) CO2; б) реагентом Шиффа; в) парахлормеркурийбензоатом (SH-реагент); г) цианидами; д) H2S; е) СО?
8 Фосфорилирование АДФ в АТФ возможно за счетсубстратов:
а) 3-ФГА; б) 1,3-диФГК; в) фруктозо-1,6-дифосфата; г) фосфоенолпирувата; д) ацетил-КоА; е) сукцинил-КоА?
9 Какие ферменты могут фосфорилировать АДФ:
а) цитратсинтетаза; б) СДГ; в) фумараза; г) a-кг-ДГ; д) протонная АТФ-аза; е) сукцинилтиокиназа?
Лабораторная работа. Количественное определение каталазы по Баху и Зубковой
Принцип метода. Основан на титриметрическом определенииколичества перекиси водорода, разложенной ферментомзаопределенный промежуток времени, по следующему уравнению:
2KMnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4 ¾® 2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2.
О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества KMnO4, израсходованного на титрованиедоипосле действия каталазы.
Активность каталазы выражают с помощью каталазногочислаи показателя каталазы. Каталазным числом называют количество миллиграммов перекиси водорода, которое разлагается в 1 мкл крови.
Ход работы. Разведенную кровь (1 : 1000) взбалтываютидобавляют по 1 мл в две колбы, приливают по 7млдистиллированной воды; в опытную пробу добавляют 2 мл 1 %-го раствора H2O2, а в контрольную – 5 мл 10 %-го раствора H2SO4. Действие каталазы в кислой среде (в контрольной пробе) прекращается, т. к. оптимум pH = 7,4.
Колбы оставляют при комнатной температуре на 30мин.Затем приливают в опытную колбу 5 мл 10 %-го H2SO4, а в контрольную– 2 мл 1 %-го H2O2. Содержимое каждой колбы титруют 0,1нраствором KMnO4 до появления бледно-розовой окраски.
Рассчитывают каталазное число (КЧ) по формуле
КЧ = (А – В) ´ 1,7,
где А – количество 0,1нраствора KMnO4, пошедшее на титрование контрольной пробы, где каталаза разрушена, мл;
В – количество 0,1н раствора KMnO4, пошедшее натитрование опытной пробы, мл.
На титрование контрольнойпробы, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора KMnO4, чем натитрованиеопытнойпробы. Полученную разность умножают на 1,7(коэффициентпересчета) и получают каталазное число для исследуемой крови.
В норме каталазное число составляет 10–15 единиц.
Клинико-диагностическое значение. Определение активности каталазы крови имеет значение для диагностики рака, анемии, туберкулеза. При этих заболеванияхактивность каталазы в крови снижается.
Примечание ‑ Показателем каталазы служит дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем – число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
Рекомендуемая литература
Основная
1 Материал лекций.
2 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 213–220; 1998. С. 305–317.
3 Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 199–221.
Дополнительная
4 Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 403–438.
5 Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 111–139.
6 Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 2. С. 403–438, 508–550.
7 АлбертсБ.идр.,Молекулярнаябиология клетки. М.: Мир, 1994.Т. 1. С. 430–459.
8 Скулачев В.П. Энергетика биологическихмембран. М.: Наука. 1989.
Занятие 7
Контрольное по разделам “введение в биохимию”, “Энзимология и биологическое окисление”
Цель занятия: контроль усвоения вопросов пройденных разделов “Введение в биохимию”, “Энзимология и биологическое окисление”.
Контрольные вопросы
1 Краткая история биохимии. Значение биохимии для врача.
2 Характеристика основных биохимических методов.
3 Общая характеристика обмена веществ. Понятие об анаболизме, катаболизме и метаболизме.
4 Строение, свойства и классификация аминокислот. Значение аминокислот.
5 Уровни структурной организации белковой молекулы. Определение структурной связи, удерживающей структуры.
6 Форма и размер белковой молекулы. Молекулярная масса белков.
7 Физико-химические свойства белков. Функции белков.
8 Качественные реакции на белки и аминокислоты.
9 Высаливание, денатурация белков (механизм, признаки). Использование денатурации в лечебной и лабораторной практике.
10 Доказательства белковой природы фермента. Выделение и очистка ферментов.
11 История энзимологии. Понятие о ферментах. Особенности ферментативного действия.
12 Строение ферментов. Кофакторы ферментов: ионы металлов и коферменты (участие витаминов в построении коферментов). Активный центр фермента (каталитический, субстратный, аллостерический участки).
13 Механизм действия ферментов. Теория промежуточных соединений. Энергия активации. Энергетический барьер.
14 Кинетика ферментативных реакций (факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций: природа фермента и субстрата, их концентрация, рН, температура, лекарственные препараты).
15 Выделение и очистка ферментов, качественное обнаружение и количественное определение. Единицы измерения количества и активности ферментов.
16 Номенклатура и классификация ферментов.
17 Локализация ферментов в клетке. Органоспецифические и маркерные ферменты. Изменения ферментативного спектра в онтогенезе.
18 Регуляция активности ферментов. Роль гормонов, цАМФ, ионов активаторов, ингибиторов. Виды ингибирования.
19 Аллостерические ферменты. Определение, структура, свойства и кинетика ферментов. Механизм регуляции. Биологическое значение.
20 Изоферменты, их биологическая роль и происхождение. Использование изоферментов в диагностике.
21 Предмет и задачи медицинской энзимологии.
22 Энзимопатии, их классификация, причины возникновения.
23 Механизм развития метаболических разрушений. Степень клинических проявлений энзимопатий.
24 Характеристика основных ферментов плазмы. Типы изменения активности ферментов в крови.
25 Энзимодиагностика. Задачи и объекты исследования.
26 Энзимотерапия (иммобилизованные ферменты, липосомы).
27 Применение ферментов в лабораторной диагностике.
28 Количественное определение каталазы (принцип метода, диагностическое значение).
29 Определение амилазы (диастазы) мочи по Вольгемуту (принцип метода, диагностическое значение).
30 История учения о биологическом окислении. Взгляды М. В. Ломоносова, А. Лавуазье, Ф. Шенбайна, А. Н. Баха, В. И. Палладина.
31 Современные представления о биологическом окислении. Принципы преобразования и передачи энергии в клетке. Окислительно-восстановительные реакции, окислительно-восстановительный потенциал.
32 Основная роль биологического окисления. Схемы образования субстратов из белков, липидов и углеводов.
33 Этапы биологического окисления (ЖКТ, цитоплазматический и митохондриальный).
34 Строение АТФ, значение. Высокоэнергетические фосфаты. Природа макроэргичности. Субстратное фосфорилирование. Биологическое значение.
35 Строение и функции митохондрий. Сравнительная характеристика мембран митохондрий. Локализация митохондриальных ферментов.
36 ЦТК как общий конечный путь использования субстратов биологического окисления. Последовательность реакций, ферменты, коферменты.
37 Значение ЦТК. Регуляция ЦТК.
38 Ферменты тканевого дыхания (НАД; ФАД-зависимые дегидрогеназы, убихинон; цитохромы, их строение, роль).
39 Витамин PP. Строение, роль в энергетическом обмене.
40 Витамин B2. Строение и роль в энергетическом обмене.
41 Дыхательная цепь. Перенос электронов в ней. Основные принципы функционирования дыхательной цепи. Комплексы ДЦ.
42 Механизмы сопряжения окислительного фосфорилирования. Строение и функции протонной АТФ-азы. Коэффициент Р/О.
43 Хемиосмотическая теория Митчелла. Механизм генерации протонного потенциала. DmН+, его структура и пути утилизации.
44 Разобщение окисления и фосфорилирования. Разобщители окислительного фосфорилирования, их природа и механизм действия.
45 Особенности митохондриального окисления в бурой жировой ткани, ее биологическая роль.
46 Значение митохондриального окисления в биоэнергетике клетки и организма.
47 Микросомальная цепь переноса электронов. Механизм окисления.
48 Значение микросомального окисления в биоэнергетике клетки и организма.
49 Сходство и отличие микросомального и митохондриального окисления.
50 Образование активных форм кислорода, их биологическая роль.
51 Антиоксидантная защита, СОД, каталаза, пероксидаза, их биологическая роль. Антиоксиданты.
52 Витамин С. Химическая природа, роль в обмене веществ.
3 Биохимия углеводов
Занятие 8
Химия углеводов. Переваривание и всасывание. Метаболизм гликогена
Цель занятия: сформировать представления о биологической роли, молекулярных механизмах переваривания и всасывания углеводов, путях метаболизма углеводов в живых организмах.