А) строение фрагментов молекул ДНК и РНК
Сверхспиральная Релаксированная
кольцевая ДНК кольцевая ДНК
Рис. 3.4. Строение молекул ДНК и РНК (а); (б) - кольцевидная ДНК
Вторичная структура – спирализация полидезоксирибо-нуклеотидной цепи, вернее двух цепей. Выяснение вторичной структуры ДНК – это одно из крупнейших открытий в биологии, так как при этом был раскрыт молекулярный механизм передачи генетической информации в ряду поколений. В 1953 году Д.Уотсон и Ф.Крик установили, что ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух антипараллельных полинуклеотидных цепей. Полинуклеотидная цепь расположена в форме спирали с одним оборотом (шагом) 10 пар нуклеотидов, что составляет 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм, при этом между амино- и кетогруппами азотистых оснований образуются водородные связи. Две нуклеотидные цепи образуют правую спираль, при этом углеводно-фосфатные группы располагаются снаружи, а азотистые основания – внутри, где аденин первой цепи соединяется двумя водородными связями с тимином второй цепи, а гуанин с цитозином тремя водородными связями. Связь A=T и Г=Ц называется комплементарной. Связь между указанными азотистыми основаниями является строго специфичной. Так, если в одной цепи последовательность нуклеотидов составляет АТГЦ, то во второй цепи будет комплементарно ТАЦГ. Таким образом, последовательность нуклеотидов в одной цепи автоматически определяет последовательность нуклеотидов в другой комплементарной цепи.
Исследования показали, что кроме указанной выше В-формы ДНК (репликативной формы), в зависимости от влажности и ряда других условий, могут быть: А-форма молекулы при транскрипции (1 виток насчитывает 11 пар нуклеотидов, цепь короче на 25%); С-формы надмолекулярных структур (1 виток имеет 9,3 пар оснований), Z-формы (левая спираль, на 1 виток приходится 12 нуклеотидов). Известны и другие формы (бок о бок форма, кольцевидная форма, одноцепочечнаяи т.д.).
Из физико-химических свойств, кроме большой длины молекулы, следует отметить денатурацию молекулы ДНК, которая происходит при повышении температуры свыше 800C. При этом происходит разрыв водородных связей между азотистыми соединениями, двухцепочечная молекула «расщепляется» на составляющие цепи. Полная денатурация ДНК - это расхождение комплементарных цепей. При охлаждении раствора денатурированной ДНК цепи до комнатной температуры (или несколько ниже 800C) происходит восстановление нативной структуры. Этот прием называется отжигом. Восстановление первоначальной структуры нуклеиновой кислоты называется ренатурацией. Образование двойной спирали ДНК по принципу комплементарности широко применяется для диагностики инфекционных болезней животных методом молекулярной гибридизации, ДНК-зондированию, полимеразной цепной реакции, для генетических исследований. Принцип комплементарности обеспечивается при синтезе новой молекулы ДНК, когда происходит удвоение молекулы - репликация ДНК, что очень важно для передачи генетических особенностей организма (рис.3.5).
Модель репликации ДНК, предложенная Уотсоном и Криком. Комплементарные цепи родительской ДНК разделяются, и каждая из них служит матрицей для биосинтеза комплементарной дочерней цепи.
Рис.3.5. Модель молекулы ДНК (а), нуклеосом (б).
Третичная структура ДНК и организация хроматина в клетках животных. Молекула ДНК является очень длинной, поэтому в клетке плотно «упакована» путем сверхспирализации с участием белков основного характера. ДНК клетки в основном находится в составе хромосом ядер и лишь небольшая часть ее находится в митохондриях. Суммарный материал хромосом – хроматин – содержит ДНК, гистоны, негистоновые белки и небольшое количество РНК.
До 50% хроматина составляют гистоны. Гистоны богаты основными аминокислотами – аргинином и лизином, на долю которых приходится до 25% аминокислотных остатков белка. Радикалы этих аминокислот при рН 7,0 протонированы (NH3+), несут положительный заряд. Гистоны соединяются с отрицательно заряженной (за счет остатка фосфорной кислоты) двухцепочечной ДНК с образованием ДНК-гистонового комплекса. Различают пять видов гистонов: Hl - богатый лизином, Н2А, Н2В - богатые лизином и аргинином, НЗ и Н4 – богатые аргинином. Все гистоны подвергаются модификациям – метилированию, ацетилированию, фосфорилированию и поли-АДФ-рибозилированию. При этом в их молекулах изменяется распределение электронной плотности, что меняет характер их связи с ДНК. Считают, что таким образом осуществляется механизм регуляции активности генов. Упаковка молекулы ДНК начинается с образования нуклеосом. Нуклеосома – это комплекс двухцепочечной молекулы ДНК с гистонами, где около 200 пар нуклеотидов делает два оборота вокруг 8 молекул гистонов (Н2А, Н2В, НЗ и Н4 по две молекулы). Между нуклеосомами расположена соединительная (линкерная) ДНК из 20-120 пар нуклеотидов, связанная с гистоном Hl (рис.3.5.(б)). Нуклеосомы обеспечивают плотную упаковку молекулы ДНК. Они упорядоченно расположены в пространстве и образуют толстые фибриллы в виде соленоидов. Такая упаковка ДНК в хроматине обеспечивает уменьшение линейных размеров ДНК в 10000 раз.
Цитоплазматическая ДНК содержится в митохондриях – 0,1% от общего количества ДНК клетки. Это двухцепочечные кольцевые молекулы, сравнительно небольшого размера (мм ≈106). В цитоплазме бактериальных клеток кроме хромосомной ДНК имеются добавочные кольцевидные молекулы ДНК, их называют плазмидами. Плазмиды способны автономно размножаться, стабильно наследуются. Мелкие плазмиды содержат генетическую информацию для 2-3 белков, а крупные могут кодировать до 200 белков. Количество их в клетке может быть различное: мелких – несколько десятков, крупных – 1-2. Плазмиды могут обуславливать вирулентность бактерии, устойчивость к отдельным антибиотикам: тетрациклину, стрептомицину и т.д. Плазмиды широко используются в генетической инженерии.
Молекула ДНК является материальным носителем генетической информации. Геном – это совокупность генов данного организма. Ген (цистрон) – участок ДНК, несущий информацию для синтеза одного белка (полипептида). Различают структурные гены, они кодируют полипептиды и РНК; регуляторные гены выполняют регуляторные функции. Количество генов в одной хромосоме зависит от сложности организма: у мелких вирусов несколько десятков, вируса оспы – около 200, бактериальных клеток несколько тысяч, генома человека около 35000.
Рибонуклеиновые кислоты
Различают рибонуклеиновые кислоты: транспортные (т-PHK), информационные (и-РНК) и рибосомные (р-РНК). Все они синтезируются в ядре клетки. Кроме того, различают вирусные РНК у РНК-содержащих вирусов, где рибонуклеиновая кислота является носителем генетической информации (вирус ящура, полиомиелита, вирус табачной мозаики и т.д.). Молекула РНК, в отличие от ДНК, состоит, за редким исключением, из одной полинуклеотидной цепи. Полинуклеотидная цепь РНК, закручиваясь на себя, образует двухспиральные шпильки.
Транспортная РНК (т-РНК) - самые мелкие молекулы РНК, построены из 75-90 нуклеотидов, Мм 23000-30000 Да. т-РНК составляет 10-20% от общего количества РНК клетки. Функция их состоит в транспортирование аминокислот в рибосомы - к месту синтеза белка и обеспечение включения аминокислот в определенные участки полипептидной цепи в соответствии с генетическим кодом. т-РНК участвуют в синтезе белка, являясь адаптерами – своеобразными переводчиками – переводят последовательность нуклеотидов в последовательность аминокислотных остатков белковой молекулы. Для каждой из 20 аминокислот имеется своя т-РНК, а для некоторых аминокислот – до 5. Например, т-РНК для лейцина имеет 5 разновидностей, т-РНК для серина тоже имеет пять различных молекул. Последовательность нуклеотидов всех т-РНК расшифрована. Молекула т-РНК представляет собой полинуклеотидную цепь в виде клеверного листа. К 3' и 2'-OH группе концевого аденозинового остатка присоединяется соответствующая аминокислота через свою карбоксильную группу, образуя аминоацил-т-РНК. В молекуле каждой т-РНК имеется специфический антикодон, состоящий из трех нуклеотидов, комплементарный кодону информационной РНК. Например, кодону в и-РНК 5'-ГЦЦ-3' соответствует антикодон 3'-ЦГГ-5'. Таким образом обеспечивается специфичность взаимодействия тРНК с иРНК (рис.11.3).
Информационная РНК (и-РНК) – синтезируется в процессе транскрипции, является точной копией отдельного гена. Количество и-РНК в клетке порядка 2-6% от общего количества РНК. Размер молекулы и-РНК зависит от размера кодируемого белка. Каждой аминокислоте соответствует в и-РНК определенная тройка (триплет) нуклеотидов, называемая кодоном этой аминокислоты. Последовательность кодонов в цепи и-РНК определяет последовательность аминокислот в белке (см. стр. 224).
Рибосомная РНК (рРНК) – синтезируется в ядрышке. В клетках животных различают несколько видов рРНК. В большой субчастице рибосом (60S) содержится 28S, 5S и 5,8S PHK, состоящие соответственно из 5000, 155 и 121 нуклеотидов, а в малой субчастице (40S) содержится 18S РНК, состоящий из 1900 нуклеотидов. В рибосомах содержатся также белки в большой субчастице 41, в малой - 30, всего 71. Белки рибосом основного характера связаны с молекулами РНК кооперативно – группами.
ФЕРМЕНТЫ
Ферменты или энзимы представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемых живыми организмами для осуществления многих тысяч взаимосвязанных химических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение большого разнообразия химических соединений
Жизнь и многообразие ее проявлений – это сложная совокупность химических реакций, катализируемых ферментами. Ферменты отличаются рядом характерных свойств от неорганических катализаторов: ферменты чрезвычайно эффективны и проявляют каталитическую активность в условиях температуры тела, нормального давления и (в основном) при нейтральных значениях рН. Каждый фермент катализирует, как правило, только одну химическую реакцию, т.е. ферменты высоко специфичны. Каждый фермент имеет специфическую первичную структуру, активность фермента контролируется как на генетическом уровне, так и посредством низкомолекулярных соединений: субстратов и продуктов реакций, катализируемых этими же ферментами.
Молекула фермента имеет уникальную структуру и, соответственно, уникальную функцию.
Учение о ферментах – ферментология, энзимология (греч. enzyme – в дрожжах, лат. fermentatio – брожение) исторически связано с процессом брожения, выделением газов.
Энзимология решает вопросы: а) молекулярной структуры ферментов; б) природы химических взаимодействий, лежащих в основе ферментативного катализа. Изучение ферментов имеет огромное значение как в теоретическом, так и в прикладном плане. Ферменты применяются в различных отраслях промышленности, сельского хозяйства, медицины. Например, вопросы заготовки кормов – сушка травы, приготовление сенажа, силоса, применение ферментных препаратов в качестве добавок к кормам – все рассчитаны на процессы, связанные с активностью ферментов.
Фармакологическое действие многих лекарственных препаратов основано на определенном механизме взаимодействия их с ферментами.
Процессы пищеварения, всасывания, все проявления жизни – рост, развитие – все связаны с действием определенных ферментов.
История. Явления брожения и переваривания известны давно, но учение о ферментах зародилось в 1814 г., когда Петербургский ученый Кирхгоф показал, что не только проросшее зерно ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал с превращением его в мальтозу. Вещество, извлекаемое из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крахмал в мальтозу, получило название амилазы. В последующем были открыты другие ферменты, в частности пепсин, трипсин, вызывающие гидролиз белков в желудочно-кишечном тракте. Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления в организме. Например, было известно, что горение сахара на воздухе происходит медленно, если же добавить немного солей лития, то горение сахара идет очень интенсивно в соответствии со следующим уравнением:
C6H12O6+ 6O2 6CO2+ 6H2O
В живых организмах "горение", точнее окисление углеводов также протекает быстро и до тех же конечных продуктов, т.е. CO2 и H2O с выделением энергии. Однако, эта реакция происходит при относительно низкой температуре, без пламени, в присутствии воды. Это "горение", окисление сахара в организме происходит под действием биологических катализаторов – ферментов. Сейчас известно, что при окислении глюкозы до CO2 и H2O участвуют до 15 различных ферментов.
Биологические катализаторы – ферменты осуществляют те же реакции, которые возможны по термодинамическим условиям, но они их лишь ускоряют, так же, как и неорганические катализаторы. Пример: перекись водорода H2O2 может медленно расщепляться на молекулярный кислород O2 и H2O и в отсутствие катализатора, но в присутствии платины (порошок) эта реакция идет с высокой скоростью:
2H2O2 2H2O + O2
платина или каталаза
Эту же реакцию можно провести с высокой скоростью в присутствии фермента каталазы (например, содержащегося в эритроцитах), при этом образуются те же конечные продукты.
Таким образом, можно считать установленным, что ферменты катализируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям, катализирующимся неорганическими веществами.
Ферменты долгое время считали "организованными" (Л.Пастер) и "неорганизованными", т.к. полагали, что ферменты, сбраживающие сахар, связаны с целой клеткой, а кипячение инактивирует фермент. Лишь опыты М.М. Манасеина (1871 г., растертые с измельченным песком дрожжи), Бухнера (1897 г. дрожжевой сок, полученный под давлением 500 атм.), Лебедева A.H. (зимаза из дрожжей, получена настаиванием высушенных дрожжей в теплой воде) показали, что ферментативная активность не связана с целой клеткой, что фермент может быть выделен из клеток. Это послужило началом детального изучения процесса анаэробного окислительно-восстановительного расщепления углеводов. В настоящее время установлено, что любая химическая реакция, протекающая в организме может быть осуществлена вне организма, если удается выделить соответствующий фермент, катализирующий данную реакцию. Правда следует учесть, что ряд ферментов прочно связан с морфологическими структурами клетки – с биомембранами. В целостном организме имеется тесная связь между функцией фермента и его структурой, связанной с клеточными образованиями.