Работа № 1. Качественное определение цитрата и сукцината флуориметрическим методом
Принцип метода: Ди- и трикарбоновые кислоты, карбоксильные группы которых разделены не более чем двумя атомами углерода (НООС-СR2-СR2-СООН), при взаимодействии с резорцином в присутствии серной кислоты образуют флуоресцирующие продукты.
Реактивы: кристаллы цитрата, сукцината и резорцина, конц. серная кислота, дистиллированная вода. Посуда: пробирки, капельницы, склянки. Оборудование: горелка, флуороскоп.
Работа № 1. Качественное определение сукцинатдегидрогеназы (СДГ).
Принцип метода:
Реактивы: гомогенат мышечной ткани, фосфатный буфер, растворы кислот (янтарная, малоновая), метиленовая синь, дистиллированная вода. Посуда: пробирки, бюксы, центрифужные пробирки, пипетки, бюретки. Оборудование: термостат, центрифуга, микродозаторы. СДГ интенсивно окисляет сукцинат, при заболеваниях, сопровождаемых или вызванных гипоксией, увеличивая, таким образом, генерацию АТФ, снимая энергетический дефицит в тканях. Янтарная кислота применяется как лекарственный препарат при гипоксиях.
Работа № 2. Количественное определение активности каталазы по Баху и Зубковой.
Принцип метода:
Каталаза – фермент катализирующий окислительно-восстановительную реакцию между двумя молекулами пероксида водорода: 2НООН ─каталаза→ 2НОН + О2.
В основе количественного определения каталазы лежит определение количества пероксида водорода, разложенного ферментом за определенный промежуток времени, по уравнению: 2KMnO4 + 5 H2O2 + 4 H2SO4 ↔ 2KHSO4 + 2 MnSO4 + 8HOH + 5O2
Активность фермента выражают каталазным числом и показателем каталазы. Каталазным числом (КЧ) называют количество H2O2 мг, которое разлагается в 1 мкл (мл) крови. Показателем каталазы называют отношение каталазного числа к количеству млн эритроцитов в 1 мкл крови. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества KMnO4, израсходованного на титрование контрольной и опытной пробы.
Реактивы: раствор крови (готовит лаборант: 0,1 мл цельной крови в мерной колбе доводят до 100 мл дистиллированной водой. В 1 мл растворе крови – 1 мкл цельной крови), дистиллированная вода, пероксид водорода (1%), H2SO4 (10%), раствор KMnO4 (0,1Н). Посуда: конические колбы, пипетки, бюретки, мерные пробирки. Оборудование: электроплита, микродозаторы. Определение активности каталазы крови имеет значение для диагностики анемии, туберкулеза и онкологических заболеваний. При этих заболеваниях активность каталазы в крови снижается.
Работа № 1. Определение активности ЛДГ в сыворотке крови.
Принцип метода: основан на определении скорости снижения реакции катализируемой ЛДГ. Спектрофотометрическое определение оптической плотности при окислении НАДН2 в НАД+ проводят при длине волны 340 нм (тест-Варбурга).
ПВК + НАД·Н + Н+ ← лактатдегидрогеназа → МК + НАД+
Скорость падения Е (оптической плотности) пропорциональна снижению концентрации НАДН и активности ЛДГ.