Схема постановки ИФА для выявления противовирусных антител

Последовательность выполнения ИФА № лунки полистиролового планшета
КПС КОС КК Исследуемая сыворотка 1 Исследуемая сыворотка 2
Сорбированный очищенный антиген инактивированного ВИЧ + + + + +
Исследуемая сыворотка в разведении 1:100 + + + + +
Инкубация + + + + +
Отмывка лунок + + + + +
Антитела против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой + + + + +
Инкубация и отмывка + + + + +
Субстрат для выявления иммуноферментного комплекса + + + + +
Измерение показателя оптической плотности 0,4 0,1 0,05 0,2 0,7
Заключение       - +

При оценке результатов ИФА учитывают 2 параметра: активность тест-системы и нижнюю границу оптической плотности положительных проб (ОП погрешности). Активность тест-системы определяют по формуле: средняя ОП КПС/средняя ОП КОС >3, то есть тест-система является пригодной для использования, если средний показатель оптической плотности контрольной положительной сыворотки (ср. ОП КПС) превышает средний показатель оптической плотности контрольной отрицательной сыворотки (ср. ОП КОС) в 3 раза и более. При этом средний показатель ОП КОС не должен превышать 0,3, а контроля конъюгата (КК) – 0,1. Положительной считают ту исследуемую сыворотку крови, показатель ОП которой превышает показатель ОП погрешности, равный ОП КОС + 0,2.

Модификацией ИФА является метод иммуноблота. Вначале физико-химическими способами проводят разрушение вирусов на составляющие их белки, гликопротеины и гликолипиды, которые затем фракционно разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. После этого проводят электрофоретический перенос вирусных белков из геля на нитроцеллюлозную бумагу. Поскольку электрофоретическая подвижность вирусных белков различна, они располагаются на нитроцеллюлозной бумаге фракционно. Благодаря этому становится возможной идентификация антител сыворотки крови к индивидуальным белкам (антигенам) вирусов. Для этого на нитроцеллюлозные полоски наносят исследуемую сыворотку, проводят инкубацию и отмывку. После этого полоску обрабатывают антителами против иммуноглобулинов человека и вновь инкубируют и отмывают. На завершающем этапе наносят субстрат для выявления иммуноферментного комплекса. Положительная реакция в иммуноблоте выявляется в виде окрашенных полос на нитроцеллюлозной мембране. По специфичности вирусных белков определяют специфичность сывороточных антител. Метод иммуноблота широко используется для диагностики ВИЧ-инфекции.

Радиоиммунный анализ (РИА). Является высоко чувствительным и высоко специфичным способом серологической диагностики вирусных заболеваний. РИА проводится не на твердой фазе, а в растворе, что обеспечивает большую доступность всех антигенных детерминант для взаимодействия с антителами.

В основе РИА лежит реакция радиоиммунопреципитации – РИП. В качестве вирусных антигенов используются меченные радионуклидами белки вирусов, которые метят I125 или S35 при выращивании вирусов в чувствительных клетках в присутствии радиоактивно меченных аминокислот. Выделяют следующие этапы РИП. 1. Смешивание меченных структурных вирусных белков с исследуемой сывороткой с целью образования иммунных комплексов антиген-антитело. 2. Выделение иммунных комплексов из раствора путем преципитации с гранулами сефарозы и белка А Staphylococcus aureus с последующим центрифугированием. 3. Диссоциация иммунных комплексов с помощью детергентов и электрофорез в полиакриламидном геле. 4. Проведение авторадиографии геля для определения подвижности и молекулярной массы вирусных белков. Таким образом, определяют, какие именно вирусные белки оказались в составе иммунных комплексов с антителами и, следовательно, антитела, к каким именно белкам вируса присутствуют в исследуемой сыворотке крови. РИП как экспертный метод используется для диагностики ВИЧ-инфекции.