К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 31

(для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический Курс: 2

1. Тема занятия: Биохимия печени и метаболизм ксенобиотиков.

2. Учебная цель занятия: Изучить особенности метаболизма печени в норме и при патологии, оценивая ее функциональное состояние с помощью биохимических показателей крови и мочи.

3. Задачи занятия:

1. Используя вопросы для самоподготовки, основную и дополнительную литературу изучить теоретический материал по биохимии печени и метаболизму ксенобиотиков.

2. Ознакомиться с основными печеночными нагрузками и биохимическими показателями, характеризующими функциональное состояние печени.

3. Изучить основные механизмы обезвреживания в печени эндогенных продуктов обмена и ксенобиотиков.

4. Приобрести практические навыки определения концентраций общего конъюгированного и неконъюгированного билирубина в сыворотке крови. Научиться использовать результата лабораторных биохимических исследований при диагностике патологических процессов (в печени) и оценивать их степень тяжести и динамику развития с помощью тимоловой пробы.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. По цифровым значениям тимоловой пробы, полученным при исследовании двух образцов сыворотки крови, оценить функциональное состояние печени пациентов и поставить предположительный лабораторный диагноз.

2. Определить: концентрации общего, свободного и связанного билирубина в сыворотке крови, указать диагностическое значение определения этих показателей и поставить предположительный лабораторный диагноз.

3. Написать формулы прямого и непрямого билирубина.

4. Оформить результата лабораторных исследований в виде таблиц.

5. Выполнить тест-контроль по теме биохимия печени и метаболизм ксенобиотиковов.

Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Тимоловая проба (диспротеинемический тест) и ее клинико-диагностическое значение.

Клинико-диагностическое значение: Тимоловая проба (ТП) - является одной из наиболее чувствительных осадочных проб и фиксирует дис- и парапротеинемию по изменению соотношения альбуминов и β, γ- глобулинов, липопротеидов, фосфолипидов и по появлению в сыворотке крови высокомолекулярных аномальных белков. Проба не специфична, так как дает положительный (+) ответ при острых и хронических воспалительных процессах протекающих в различных органах и тканях (печень, почки, легкие, соединительная ткань и т.д.).

ТП имеет цифровое выражение - от 0 до 20 и более ед. S-H, по которому можно судить о наличии патологического процесса и его и его степени тяжести и динамика развития. В норме (отсутствие воспаления) - ТП отрицательная –ТП (-), равна на 0-4 ед. S-Н, ТП (+) - при 5 -20 и более ед. S-Н.

В клинике ТП используется наряду с другими биохимическими тестами при диагностике заболеваний печени: ТП (+) - при острых вирусных и хронических токсических гепатитах, декомпенсированном циррозе, раке и его метастазах в печень. ТП (+) при печеночной желтухе. ТП (-) при надпеченочной и подпеченочной желтухе (без цитолиза).

Принцип метода: При взаимодействии сыворотки крови с тимоло-вероналовым буфером (рН=7,55) появляется помутнение вследствие образования глобулин-холестерин-липопротеид-тимол-фосфолипидного комплекса. Его интенсивность связана с количеством и % соотношением отдельных фракций. Степень помутнения оценивается нефелометрически на ФЭК.

Ход работы: Приготовить в пробирках растворы: Таблица 1

№ пробирки	Пробирки (мл)
Тимолово-вероналовый буфер	Н₂О дист.	Сыворотка 1	Сыворотка 2
«0» (контроль)		0,1	-	-
		-	0,1	-
		-	-	0,1

Содержимое пробирок перемешать и выдержать 30 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность Е₁ и Е₂ растворов измерить против "0" - (контрольная проба) на ФЭКе при длине волны 660 нм (красный светофильтр). Цифровые значения ТП (в условных ед. S-Н) вычисляло по формулам:

ТП₁ = Е₁ · 40,5, ТП₂ = Е₂ · 40,5, где Е₁ и Е₂ – оптические плотности сывороток 1 и 2; 40,5 – переводной коэффициент в ед. S-Н.

Он рассчитывается по формуле: [С]/Ест = 40,5, где [С] – концентрация раствора сравнения (48 ммоль/л BaCl₂); Ест – оптическая плотность раствора BaCl₂ против воды.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

Результаты работы оформить в виде таблицы:

Таблица 2

№ пробы	Е (оптическая плотность)	Цифровое значение ТП (в ед. S-H)	«+» или «-»	Вывод (предположительный лаб. диагноз):
	Е₁=	ТП₁=
	Е₂=	ТП₂=

Работа № 2. Определение концентрации общего билирубина и его фракций (неконъюгированного и конъюгированного билирубина) в сыворотке крови по Йендрашику.

Клинико-диагностическое значение: Определение общего билирубина и его фракций (некоъюгированного и конъюгированного билирубина) в сыворотке крови и уробилиногена в моче относится к обязательным биохимическим исследованиям при диагностике заболеваний печени, так как позволяет установить уровень нарушения пигментного обмена и дифференциально диагностировать желтухи.

Содержание общего билирубина (БРобщ) в сыворотке крови в норме составляет 8,5-20,5 мкмоль/л (0,5-1,2 мг%), из них 75% приходится на долю свободного (неконъюгированного) билирубина (БРнекон).

Гипербилирубинемия (повышение концентрации БР в сыворотке крови) - является результатом нарушения динамического равновесия между скоростью образования и выделения БР и может быть вызвана различными причинами (гемолиз, цитолиз, холеотаз).

Повышение концентрации БР в сыворотке крови до 28мкмоль/л и более сопровождается желтушной окраской кожных покровов, слизистых оболочек склер глаз т.е. желтухой (за счет отложения в тканях диффундирующего из крови БР).

Принцип метода: Общий билирубин сыворотки крови (БРнекон. и БРкон.) определяется на основе реакции с диазореактивом (диазотированной сульфаниловой кислотой) после диссоциации комплекса альбуминов плазмы и БРнекон, в присутствии кофеинового реактива и перехода БРнекон в растворимое состояние. БРкон (растворимый) дает с диазореактивом розовое окрашивание сразу (без кофеинового реагента).

Интенсивность окрашивания исследуемого раствора пропорциональна концентрации азобилирубина в сыворотке крови и оценивается колориметриметрически на ФЭКе.

Концентрация БРнекон определяется расчетным путем как разность между концентрациями БРобщ и БРкон.

Ход работы: Приготовить в пробирках растворы:

Таблица 3

№	Реактивы (мл)	№ пробирки и определяемое вещество
1. БРобщ	2. БРкон	3. Контроль
	Сыворотка крови
	Кофеиновый реактив	3,5	-	3,5
	Физ. раствор	-	3,5	0,5
	Диазореактив	10 капель	10 капель	-

Содержимое пробирок перемешать, пробирку № 2 (БРкон) выдержать 5 минут, а пробирку № 1 (БРобщ) - 20 минут при комнатной температуре. Затем замеряют оптическую плотность этих растворов (Е₁ и Е₂) против контрольной пробы (пробирка №3) на ФЭКе при длине волны 560 нм (зеленый светофильтр). Е - оптическую плотность стандартного раствора билирубина (концентрация БРобщ = 2 мг%) фотоколориметрируют против воды.

Концентрацию БРобщ в сыворотке крови (С_БРобщ) вычисляют по формуле:

С_БРобщ = Е₁/Ест · 2 мг%, где 2 - концентрация БРобщ в стандартном растворе.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

Результаты работы оформить в виде таблицы:

Таблица 4

	Оптическая плотность Е	Е₁	Е₂	Ест
	Концентрация БР в сыв. крови	[БРобщ]	[БРкон]	[БРнекон]

Концентрация БРнекон рассчитывается по формуле: БРнекон = БРобщ - БРкон

Вывод: предположительный лабораторный диагноз.

Работа №3: Решение ситуационных задач (см. приложение).

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 04. 2011 г.

10. Учебное задание подготовлено поч. Ванчуговой Н.Н.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2011 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 32/1

(для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический

Курс: 2

1. Тема занятия: Особенности метаболизма при старении

2. Учебная цель занятия: Изучить изменение обмена веществ в организме при старении

3. Задачи занятия:

1. Изучить теоретический материал о причинах, механизмах старения, изменении важнейших видов обмена веществ и их интеграции при старении.

2. Изучить теоретический материал по особенностям возрастзависимого изменения важнейших лабораторных биохимических показателей периферической крови.

3. Исследовать в ходе выполнения лабораторной работы изменения концентрации об. холестерина (об. белка) в пробах периферической крови практически здоровых людей зрелого и пожилого возраста.

4. Рассмотреть результаты готовых данных исследования перекисного окисления липидов периферической крови людей разного биологического и паспортного возраста, сделать выводы о степени влияния биохимических изменений на темп старения (ситуационные задачи).

5. Обобщить теоретический материал, данные лабораторной работы и ситуационных задач, сделав выводы об изменении обмена веществ и возможности его коррекции при старении, особенностях биохимической диагностики в геронтологии.

4.Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Исследовать концентрацию холестерина (общ. белка) в периферической крови практически здоровых людей зрелого и пожилого возраста ( работа № 1 и № 2).

2. Изучить лабораторные данные биохимических исследований людей разного биологического и паспортного возраста (см. приложение СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ), сделать заключение о вкладе уровня перекисного окисления липидов в процесс старения организма, наметить пути коррекции.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1 Исследование концентрации холестерина в периферической крови у людей разного возраста.

Принцип метода. При гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и имеющиеся в пробе холестерин окисляются кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Ход работы: В пробирках готовят следующие растворы (табл. №1):

Таблица 1

Состав пробирок для определения холестерина

Компоненты проб	№ пробирки
1 (А1)	2 (А2)	3 (В)
Сыв-ка крови человека зрелого возраста	0,02 мл	-	-
Сыв–ка крови человека пожилого возраста		0,02 мл
Стандартный р-р холестерина	-	-	0,02 мл
Реагент	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл

Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают 15 минут при температуре 20 градусов (комнатной температуре). Оптическую плотность всех растворов измеряют при зеленом светофильтре ФЭКа ( длина волны 490 нм. ), “ноль” устанавливают по воздуху.

Концентрацию холестерина в сыв-ке крови вычисляют по формуле:

Схс = Е_{А1, А2}/ Е_В* 5,17 ( ммоль/л ) или С_ХС = Е_А1,А2 /Е_В * 200 ( мг/100 мл ), где

Схс - концентрация холестерина в сыворотке крови, равная 2 м Моль/л

Е_А1, Е_А2 – оптическая плотность опытных растворов, Е_В- оптическая плотность стандартного раствора.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

Оформить результаты работы в виде таблицы 2:

Таблица 2

Результаты исследования концентрации холестерина в сыворотке крови практически здоровых людей зрелого и пожилого возраста

№ пробирки
Оптическая плотность
Значение концентрации холестерина ( мМоль/ л)

В выводе сравнить между собой, а также с возрастными нормами из литературных источников, численные значения концентрации холестерина в сыворотке крови людей зрелого и пожилого возраста, объяснить обнаруженные различия исходя из возрастных особенностей метаболизма этого вещества и его регуляции.