Работа № 2. Исследование концентрации общего белка в периферической крови

Принцип метода. Белок образует окрашенный комплекс с ионами меди в щелочной среде.

Ход работы: В пробирках готовят следующие растворы ( табл. 3):

Таблица 3.

Компоненты проб	№ пробирки
1 (А 1 )	2 ( А 2)	3 (В)
Сыв-ка крови человека зрелого возраста	0,1	-	-
Сыв-ка крови человека старого возраста	-	0,1	-
Стандартный р-р белка	-	-	5,0
Рабочий р-р	5.0	5,0	5,0

Содержимое пробирок перемешивают, выдерживают при комнатной температуре 20-25 градусов в течение 30 минут. Оптическую плотность всех растворов измеряют при длине волны 540 нм., «ноль» устанавливают против контроля.

Концентрацию общего белка в сыв-ке крови вычисляют по формуле:

С_ОБ. = ( Е_А1 / Е_ст) * 70, где

С_ОБ.- концентрация общего белка в сыв-ке крови в г/л;

Е_А1,А2 – экстинция опытных проб;

70 – концентрация белка в стандарте в г/л.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов.

Оформить результаты работы в виде таблицы 4:

Таблица 4.

Результаты исследования концентрации об. белка в сыворотке крови практически здоровых людей зрелого и пожилого возраста

№ пробирки
Оптическая плотность
Значение концентрации общего белка (мМоль/л)

В выводе сравнить между собой, а также с возрастными нормами из литературных источников численные значения концентрации общего белка в сыворотке крови людей зрелого и пожилого возраста, объяснить обнаруженные различия.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 04. 2011 г.

10. Учебное задание подготовлено проф. Мещаниновым В.Н., асс. Голомолзиным Б.В., студ. 2 курса Батыршиным Г.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2011 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 32/2

(для студентов)

Факультеты: педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Биохимия молока и лактации.

2. Учебная цель занятия: Изучить нейроэндокринную регуляцию развития молочных желез и лактации; механизмы образования молока, химический состав и питательную ценность в различные сроки лактации.

3. Задачи занятия:

1. Ознакомиться со структурой, биохимической ролью и метаболизмом гормонов, регулирующих развитие и лактацию молочных желез.

2. Изучить в сравнительном аспекте физико-химические свойства, качественный и количественный химический состав, питательную ценность различных видов женского молока и зрелого коровьего.

3. Научиться определять в молоке содержание химических веществ, проводить специфическую реакцию Умикова с целью отличия женского молока от коровьего.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Получение осадка казеина и его открытие.

2. Открытие альбуминов и глобулинов в молоке биуретовой реакцией.

3. Отделение альбуминов и глобулинов.

4. Открытие в безказеиновом фильтрате молока кальция, неорганического фосфора, лактозы, аминокислот, витаминов А, В₂.

5. Проведение специфической реакции Умикова.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Осаждение казеиногена.

В пробирку отмеривают 2 мл 0,1 н СН₃СООН и 2 мл 0,1 н CH₃COONa. Полученный раствор представляет буферную смесь с рН=4,7, соответствующим изоэлектрической точке казеиногена. Добавляют в пробирку 20 капель молока, раствор взбалтывают, казеиноген выпадает в осадок. Через 5—7 минут жидкость отфильтровывают от осадка казеиногена через двойной бумажный фильтр. Если фильтрат получается мутным, повторяют фильтрование. Фильтрат и осадок казеиногена сохраняют для дальнейших исследований.

На фильтр с осадком казеиногена наливают 10—12 капель 0,1 н Na₂CO₃. Казеиноген растворяется в соде и раствор его проходит через фильтр. Открывают казеиноген в растворе биуретовой реакцией, прибавляя к нему 5 капель 10% NaOH и 2 капли 2% CuSО₄.

Работа № 2. Отделение альбуминов и глобулинов.

К 1 мл фильтрата после осаждения казеиногена добавляют 1 мл насыщенного раствора сернокислого аммония и оставляют стоять 10 минут. Жидкость мутнеет вследствие выпадения в осадок глобулинов. Отфильтровывают осадок глобулинов через бумажный фильтр. К полученному фильтрату добавляют кристаллический сернокислый аммоний до полного насыщения— выпадает осадок альбуминов.

Работа № 3. Открытие кальция, фосфора, лактозы, аминокислот.

Открытие кальция. Отмеривают в пробирку 10 капель фильтрата после осаждения казеиногена и добавляют 10 капель раствора щавелевокислого аммония. Раствор мутнеет вследствие образования осадка щавелевокислого кальция.

Открытие фосфора. К 10 каплям фильтрата после осаждения казеиногена добавляют 5 капель раствора молибденово-кислого аммония, 5 капель 1% гидрохинона и через 5 минут 10 капель карбонатсульфита. Развивается синее окрашивание.

Открытие лактозы. Остаток фильтра после осаждения казеиногена нагревают в пробирке до кипения и в кипящую жидкость по каплям прибавляют 0,1 н Na₂CO₃ до полного осаждения (выпадения в виде хлопьев) альбуминов и глобулинов. Добавление Na₂CO₃ производят с целью довести реакцию среды до рН, соответствующего изоэлектрической точке этих белков. Жидкость охлаждают до комнатной температуры, осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Полученный фильтрат делят на 2 части. В одной из них открывают присутствие лактозы реакцией Фелинга. Для этого к фильтрату добавляют по 10 капель реактивов Фелинга I и II нагревают до кипения.

Открытие аминокислот. Ко второй части фильтрата добавляют 5 капель 0,1 н СН₃СООН, 3 капли 1% водного раствора нингидрина и кипятят 1—2 минуты. Развивается фиолетовое окрашивание.