Учебно-методическое пособие

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ

ПО КУРСУ

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Учебно-методическое пособие

 

Специальность: 050102 – «Биология»

Череповец 2006

 

 

Рассмотрено на заседании кафедры биологии и общей экологии, протокол № от 00.00.06 г.

 

Одобрено редакционной комиссией Физико-математического факультета ЧГУ, протокол № от г.

 

С о с т а в и т е л ь: И.А. Непорожняя

 

 

Р е ц е н з е н т ы:

 

Н а у ч н ы й р е д а к т о р: Н.П. Коломийцев, канд. биол. наук, доцент

 

Ó Череповецкий государственный университет,

 

 

Введение

 

Данное пособие предназначено для студентов II курса специальности «Биология». Пособие включает в себя темы: «Белки», «Количественные методы в биохимии», «Ферменты», «Витамины», «Нуклеиновые кислоты», «Фотосинтез», «Углеводы. Липиды», «Химия молока». В пособие включены лабораторные работы, которые могут быть выполнены в течение 4 ч, отводимых для занятия.

Выполнение данных лабораторных работ будет способствовать усвоению студентами теоретического курса «Биологической химии», развитию способности к мышлению и наблюдательности, развитию практических навыков биохимического эксперимента. Теоретической основой лабораторного занятия является краткое изложение программных вопросов по данной теме, указаны объекты исследования, оборудование и реактивы, инструкция по проведению эксперимента.

В ходе выполнения лабораторной работы каждый студент заполняет протокол работы, включающий: название темы, работы, исследуемый материал, оборудование, реактивы, краткое описание хода работы, результаты исследования. Необходимые рисунки, схемы оформлять в разделе ход работы. По окончании каждой работы необходимо записывать выводы.

Лабораторные работы в данном учебном пособии подобраны с учетом технических возможностей кафедры. В конце пособия находится приложение с описанием приготовления реактивов. Лабораторные работы разработаны на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального образования по дисциплине «Биологическая химия». – М.: Государственный комитет РФ по высшему образованию, 2005, для специальности 050102 – «Биология».

 

Особенности работы в биохимической лаборатории и инструктаж по технике безопасности

 

Приступая к выполнению практических занятий, следует изучить теоретический материал по учебной литературе, внимательно ознакомиться с содержанием очередного лабораторного занятия.

Работа с биологическим материалом (кровь, моча, слюна, желудочный сок, гомогенаты тканей) должна выполняться в меди­цинских перчатках. Следует ис­пользовать автоматические дозаторы, бюретки и мерные цилиндры. Стеклянные пипетки в области контакта со ртом перед работой обработать этанолом.

Следует использовать реагенты, маркировка которых указана на этикетке (вещество, концентрация, дата изготовления). Работа с концентрированными кислотами и щелочами, ядовитыми и огнеопасными веществами производится в вытяжном шкафу. Реагенты использовать экономно, химические реактивы необходимо брать только чистыми инструментами, после взятия необходимого количества банку с реактивом закрыть предназначенной для нее крышкой.

Все электрические приборы должны быть исправными и надежно заземленными. В рабочем состоянии крышки термостатов, сухожаровых шкафов, центрифуг должны быть закрыты. Распределительный электрический щит, к которому подключены приборы, включается только в присутствии и под контролем преподавателя.

В лабораторные центрифуги помещают парное (четное) количество тщательно уравновешенных пробирок. Ось симметрии между двумя пробирками должна проходить через ось ротора. Перед включением и в процессе работы роторная камера центрифуги должна быть закрыта. Камера может быть открыта только после полной остановки ротора.

Нельзя нагревать посуду из простого химического стекла на открытом пламени. Нагревание огнеупорных пробирок на пламени спиртовки следует производить на уровне верхней границы жидкости, при этом отверстие пробирки должно быть направлено в безопасную сторону, пробирку держат с помощью держателя. Огнеопасные вещества следует нагревать только на водяной бане (не в коем случае не на открытом пламени!), контролируя наличие воды. Спиртовки гасить колпачком и следить за правильным положением фитиля.

Работу на измерительной аппаратуре следует производить в присутствии преподавателя или ответственного лаборанта кафедры, предварительно ознакомившись с правилами работы и техникой безопасности.

Необходимо аккуратно обращаться с лабораторной посудой, чтобы в случае ее повреждения не получить травму. О любых ситуациях, способных нанести вред здоровью, незамедлительно информировать преподавателя. После завершения работы убрать рабочее место, отключить электричество, а также убедиться, что краны холодной и горячей воды закрыты.

 

Тема 1

БЕЛКИ

(4 ч)

 

Работа 1.Цветные реакции на белки и аминокислоты.

Цветные реакции дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях и получить представление о его аминокислотном составе.

Биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке. Её способны дать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей.

Нингидриновая реакция характерна для α-аминогрупп. Нингидриновая реакция используется для количественного определения α-аминокислот в аминокислотных анализаторах.

Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот – триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих бензольное ядро.

Реакция Миллона открывает в белке циклическую аминокислоту тирозин. Белки, не содержащие тирозин этой реакции не дают.

Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно.

 

Исследуемый материал: раствор яичного белка (способ приготовления в приложении).

Оборудование: градуированная пипетка объемом 1 мл, пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт, стеклянные палочки, пробиркодержатель, штатив, спиртовка.

Реактивы: 1) 10% раствор NaOH, 2) 1% раствор CuSO4, 3) 0,5% раствор нингидрина, 4) HNO3 (конц), 5) реактив Миллона, 6) реактив Фоля, 7) дистиллированная вода.

 

Ход работы

Провести цветные реакции на исследуемом растворе яичного белка. Полученные результаты оформить в виде таблицы:

 

Реагент Количество реагента, капель
Опыт Контроль
Биуретовая реакция
Раствор белка -
Вода -
NaOH, 10%
CuSO4, 1%
Наблюдение окрашивания        
Нингидриновая реакция
Раствор белка -
Вода -
Раствор нингидрина
Кипятить 1-2 минуты
Наблюдение окрашивания        
Ксантопротеиновая реакция
Раствор белка -
Вода -
HNO3, конц.
Кипятить до появления окраски раствора белка
Наблюдение окрашивания        
Реакция Миллона
Раствор белка -
Вода -
Реактив Миллона
Нагреть до окрашивания осадка белка
Наблюдение окрашивания        
Реакция Фоля
Раствор белка -
Вода -
NaOH, 30%
(CH3COO)2Pb, 5%
Кипятить до появления окрашивания
Наблюдение окрашивания        

 

Работа 2. Реакции осаждения белков.

Реакции осаждения белков могут быть обратимыми и необратимыми. В первом случае белки не подвергаются глубоким изменениям, поэтому по­лучаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном раствори­теле с сохранением своих нативных свойств. При необратимых реакциях осажденные белки подвергаются глубоким изменениям — денатурации.

Реакции осаждения дают возможность: 1) изучить свойства бел­ков; 2) освободить жидкость от присутствия белка; 3) установить на­личие белка в биологических жидкостях, например в моче; 4) выса­ливанием с помощью различных концентраций нейтральных солей или спиртом выделить отдельные белковые фракции.

Реакция высаливания (осаждения белков с помощью высоких концентраций нейтральных солей) обусловлена дегидратацией мак­ромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация одних и тех же солей. Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины — в насыщенном растворе сернокислого аммония.

Осаждение белков солями тяжелых металлов (в отличие от выса­ливания) происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и ком­плексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исклю­чением солей AgNO3, HgCl2), но нерастворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатура­цию.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатура­цию белка. Выпадение белка в виде осадка связано с денатурацией белковых частиц и образованием комплексных солей белка с кисло­тами. Ортофосфорная кислота (H3PO4) осадка не дает. В избытке всех мине­ральных кислот, за исключением азотной (HNO3), выпавший в осадок белок растворяется.

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение бел­ков, чаще используют растворы трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот. Кро­ме белков она осаждает также продукты их распада — высокомолеку­лярные пептоны и полипептиды. Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков.

В органических растворителях (этанол, ацетон и др.) белки не рас­творяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Этанол свя­зывает воду, вызывая дегидратацию мицелл белка и неустойчивость их в растворе. При осаждении этанолом раствор белка должен быть нейт­ральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция облегчается при­сутствием электролита хлористого натрия вследствие снятия заряда с частиц белка. Реакция осаждения белка этанолом или кратковремен­ным действием этанола обратима при охлаждении. Если осадок быстро отделить от этанола, то белок может сохранить нативное состояние.

Осаждение белков алкалоидными реактивами также относится к необратимым реакциям. К группе алкалоидных реактивов принад­лежат танин, пикриновая кислота и др. Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами связан с образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотсодержащими группами белка. Белки — протамины и гистоны, несущие положительный за­ряд, хорошо осаждаются алкалоидными реактивами в нейтральной среде без подкисления.

Исследуемый материал: раствор яичного белка (способ приготовления в приложении).

Оборудование: градуированная пипетка объемом 1 и 5 мл, пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 15 шт, стеклянные палочки, спиртовка, воронка, фильтровальная бумага, штатив для пробирок, пробиркодержатель.

Реактивы: 1) 1% раствор СН3СООН, 2) 10% раствор NaOH, 3) NaCl (порошок), 4) насыщенный раствор NaCl, 5) (NH4)2SO4 (порошок), 6) насыщенный раствор (NH4)2SO4 , 7) 10% раствор CuSO4, 8) 5% раствор (CH3COO)2Pb, 9) HNO3 (конц.), H2SO4 (конц.), 10) 10% раствор трихлоруксусной кислоты, 11) 20% раствор сульфосалициловой кислоты, 12) насыщенный раствор пикриновой кислоты, дистиллированная вода.

 

Ход работы

Провести реакции осаждения белка различными способами.

Опыт 1. Осаждение белков кипячением

 

№ пробы Раствор белка, капель Ход анализа Результат Вывод
Нагреть до кипения    
Нагреть до кипения+1капля раствора СН3СООН    
5капель раствора СН3СООН+кипячение    
5капль раствора СН3СООН+2капли насыщ. раствора NaCl+ кипячение    
2капли раствора NaOH+ кипячение    

 

Опыт 2. Осаждение белков при комнатной температуре нейтральными солями – высаливание

Реагенты, условия опыта Количество реагента, мл
Опыт А Опыт Б
Раствор белка
NaCl, порошок До насыщения -
(NH4)2SO4, насыщенный раствор -
Отфильтровать Через 10 мин. на фильтре глобулины Без инкубации на фильтре глобулины
Исследуется фильтрат
(NH4)2SO4, порошок - До насыщения
Результат Исследуется после кипячения  

 

Во втором варианте после осаждения альбуминов надосадочную жидкость проверяют на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.

 

Опыт 3. Осаждение белков солями тяжелых металлов

К 5 каплям раствора яичного белка осторожно прибавить 1 каплю раствора сульфата меди (II). Образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. К другой такой же порции раствора белка прилить вначале 1 каплю раствора сульфата меди (II), а затем еще 10 капель и наблюдать растворение осадка в избытке реактива. К 5 каплям раствора яичного белка прибавить 2 капли раствора ацетата свинца (II), образуется осадок, нерастворимый в воде, но легко растворяющийся в избытке осадителя.

 

Опыт 4. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

К 5 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки прилить 5 капель раствора белка так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца (проба Геллера). Осторож­но встряхнуть пробирку и добавить избыток азотной кислоты: оса­док не исчезает, так как в избытке азотной кислоты он не растворя­ется. Осаждение серной кислотой проводится аналогично реакции с азотной кислотой. К 5 каплям концентрированной серной кисло­ты осторожно по стенке пробирки прилить 5 капель раствора белка. Образуется осадок, растворимый в избытке серной кислоты (при встряхивании).

 

Опыт 5. Осаждение белков органическими веществами:

а) органическими кислотами: к 5 каплям раствора белка добавить 2 капли раствора сульфосалициловой кислоты. Выпадает осадок бел­ка. К 5 каплям раствора белка добавить 2 капли раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка;

б) спиртом: к 5 каплям раствора белка прилить 15—20 капель этанола. Раствор мутнеет. Добавить 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия. Наблюдается выпадение осадка;

в) алкалоидными реактивами: к 5 каплям раствора белка добавить 2 капли насыщенного раствора пикриновой кислоты и 2 капли рас­твора уксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

 

Тема 2

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ В БИОХИМИИ

(4 ч)

 

Работа 3 . Хроматографический метод разделения смесей.

Хроматография – это метод, применяемый для разделения различных смесей на составляющие их компоненты. Метод основан на том, что в неподвижной среде, через которую протекает растворитель, каждый из компонентов, увлекаемых растворителем, движется со своей собственной скоростью независимо от других. В зависимости от природы используемой неподвижной среды выделяют разные типы хроматографии и различные модификации хроматографических методов: адсорбционная, распределительная, ионообменная, фронтальная ионообменная хроматографии.

Исследуемый материал: метиловый оранжевый (защищенный), фломастеры.

Оборудование: хроматографическая бумага, чашка Петри, пипетка, хроматографическая камера, ножницы, карандаш, линейка.

Реактивы: 1) 10% раствор NH3, 2) дистиллированная вода.

Ход работы

Опыт 1. Разделение индикаторов. Нанесите каплю защищенного метилового оранже­вого в центр хроматографической бумаги. Высу­шите бумагу при комнатной температуре, немного по­держите ее над открытой бутылкой раствора аммиака и затем положите на чашку Петри (рис.1).Капните одну каплю воды на пятно индикатора.

 

 

 

Рис.1 Хроматографическое разделение метилового оранжевого.

Два индикатора, содержащиеся в растворе мети­лового оранжевого, двигаются центробежно с раз­ными скоростями, причем синее кольцо двигается быстрее желтого. Синее кольцо - это индикатор бромтимоловый синий, а желтое - метиловый оран­жевый.

Опыт 2. Разделение цветных чернил на составляющие компоненты. На прямоугольнике из хроматографиче­ской бумаги на расстоянии 1 см от края проведите карандашом линию. Разметьте стартовую лилию крестиками через равные интервалы; на каждый цвет чернил должно приходиться по одному крестику. Фломастерами с водорастворимыми чернилами разных цветов нанесите на каждый крестик по пятну чернил разного цвета и под каждым пят­ном отметьте его местоположение карандашом. Пятно должно быть не более 2 мм в диаметре. Высушите пятна.

Подвесьте бумагу в хроматографическую камеру таким образом, чтобы стартовая линия находилась около по­верхности растворителя, а конец бумаги был
погружен в растворитель. Растворителем служит дистиллированная вода. Продолжайте хроматографию до тех пор, пока фронт растворителя не окажется на расстоянии 1 см от верхнего края бумаги. Выньте хроматограмму и высушите ее, предварительно от­метив карандашом положение фронта раствори­теля (рис. 2).

 

Рис. 2 Движение растворителя и вещества при хоматографии

 

При хроматографии подвижность растворенного вещества относительно фронта растворителя постоянна для данного вещества. Это выражается величиной Rf:

 

Расстояние, пройденное растворенным веществом

Rf = ------------------------------------------------------------------

Расстояние, пройденное фронтом растворителя.

 

Вычислите Rf для каждого цвета.

Работа 4. Разделение аминокислот методом тонкослойной ионообменной хроматографии.

Разделение аминокислот из их смеси производят на катионообменной синтетической смоле, на которую нанесен сильный катионит в натриевой форме. При нанесении образца на пластинку все аминокислоты должны сорбироваться в стартовой позиции путем их обмена с катионом натрия. Следова­тельно, все аминокислоты в исходной пробе должны быть в форме катионов, что достигается доведением наносимого раствора до рН<2.2. Степень удержания аминокислот смолой зависит от степе­ни диссоциации основных и кислотных групп аминокислот, от числа этих групп в молекуле, от способности к гидрофобным взаимодействиям со смолой и некоторых других ус­ловий. Ароматические и основные аминокислоты (арг, гис, лиз, фен, тир), а также лейцин прочно удерживаются на катионите. Для их разделения применяют пропускание нитратного буфера рН 5.25 с концентрацией Na+ 0.35 моль через слой смолы. В этих условиях все остальные аминокислоты (кислые и нейтральные) приобретают высокую подвижность и идут с фронтом растворителя. Для выявле­ния отдельных аминокислот пластинку опрыскивают раствором нингидрина. Появляются фиолетовые пятна аминокислот, распола­гающиеся по всей длине пластинки по степени возрастания подвиж­ности аминокислот. Полуколичественная оценка содержания ами­нокислоты в смеси достигается путем сравнения величины пятна из анализируемого образца с пятном соответствующей стандартной аминокислоты.

Исследуемый материал: растворы аминокислот.

Оборудование: хроматографическая камера, пластинки для ТСХ

Реактивы: 1) стандартная смесь аминокислот, 0.01 н. НС1, 2) цитратный буфер рН 5.28, 3) нингидриновый реактив

Ход работы

На пластинке мягким карандашом отмечают линию старта на расстоянии 1.5-2.0 см от нижнего края. На этой линии через равные промежутки отмечают 7 точек для нанесения растворов аминокис­лот. С помощью капилляров наносят по 1.5 мкл (3 касания) рабочих растворов каждой из шести аминокислот и смеси аминокислот (од­но касание — 0.5 мкл, что соответствует 2*10-3 мкмоль каждой ами­нокислоты). Между касаниями пятно подсушивают. Нельзя царапать слой катионита капилляром! Таким образом, впервые шесть точек внесены последовательно арг, гис, лиз, фен, тир, лей, а в седьмую — смесь аминокислот.

В камеру для хроматографии наливают цитратный буфер с рН 5.28 на высоту 1 см и помешают пластинку с нанесенными образцами. Стартовая позиция смеси аминокислот должна быть выше уровня налитого буферного раствора. Для разделения аминокислот буфер должен подняться по пластинке ровным фронтом на высоту 15 см. Для этого требуется около 2 ч. Процесс разделения можно значи­тельно ускорить, предварительно пропитав пластинки разбавленным (в 10 раз) буфером и высушив их.

По окончании разделения пластинки вынимают из сосуда с бу­фером, нижние кромки следует промокнуть фильтровальной бумагой и пластинки высушить в вытяжном шкафу при комнатной температуре. Затем их устанавливают в наклон­ном положении в вытяжном шкафу и опрыскивают из пульверизатора нингидрином до равномерного пропитывания. Потом их снова высушивают и прогревают в термостате при 40-50 °С 20 мин. Выявляются фиолетовые пятна аминокислот (снизу вверх): арг, гис, лиз, фен, тир, лей. Необходимо сравнить положение пятен стандартных растворов аминокислот с положением их при хроматографировании смеси аминокислот. Хроматограмму зарисовать в тетради.

 

 

Работа 5. Очистка белков методом диализа.

Диализ — освобождение коллоидов от низкомолекулярных ор­ганических и минеральных примесей с помощью диффузии послед­них через мембраны. Белки в растворе благодаря значительной вели­чине молекул не диффундируют сквозь полупроницаемую мембрану.

Исследуемый материал: раствор яичного белка.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 4 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, нитки, целлофан, спиртовки, пробиркодержатель, кристаллизатор.

Реактивы: 1) 10% раствор NaOH, 2) 1% раствор CuSO4, 3) Феллингова жидкость, 4) 1% раствор яичного белка с примесью 1% раствора глюкозы, 5) дистиллированная вода.

 

Ход работы

Наливают 15-20 мл исследуемого раствора в целлофановый ме­шочек и погружают его в стакан с дистиллированной водой таким образом, чтобы открытый край мешочка выступал над поверхностью воды. Через 1 ч с водой из стакана и раствором белка, содержащим примесь углеводов, проделывают биуретовую реакцию (на белок) и реакцию Феллинга (на глюкозу), чтобы убедиться в отсутствии белка и наличии глюкозы в воде из стакана.

Биуретовая реакция. К 5 каплям исследуемого раствора приба­вить 3 капли 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди (II), перемешать. Содержимое пробирки приобретает си­не-фиолетовый цвет, что указывает на присутствие белка в растворе.

Реакция Феллинга. К 5 каплям исследуемого раствора прибавить 5 капель феллинговой жидкости и нагреть. Наблюдается образование оксида меди (I) красного цвета (Cu2O), что указывает на присутствие глюкозы в растворе.

 

Работа 6. Методы количественного определения белка на примера биуретовой реакции.

Для количественного определения белков применяют физи­ческие, химические и биологические методы.

Наибольшее распространение из физических методов количе­ственного определения белков получили три: рефрактометриче­ский (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой обла­сти спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок). Пикнометрический метод (по плот­ности белковых растворов) употребляется редко.

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простым химическим методом опреде­ления белка является количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от раство­римых азотсодержащих веществ) азота. Умножая величину процентного содержания общего азота на коэффициент 6.25 (среднее содержание азота в белках—16%, отсюда 100:16 = 6.25), получают данные о содержании сырого протеина. Про­делывая ту же операцию с величиной, характеризующей содер­жание белкового азота, получают данные о количестве белка. Эти способы условны, так как дают приблизительную оценку о количестве белка.

Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической ак­тивности препарата, можно составить представление о содержа­нии в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод тоже не дает абсолютных результатов.

Самым распространенным химическим методом количествен­ного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности окраски цветных реакций, раз­вивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специ­фическим реагентом. Чтобы рассчитать концент­рацию белка, в этом случае строят калибровочный график.

Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодейст­вии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интен­сивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

Материал для исследования: растворы яичного белка концентрации 5, 10 и 15 мг/мл, и раствор белка неизвестной концентра­ции.

Оборудование: штативы с пробирками; бюретки для биуретового реактива; склянки с растворами белка; пи­петки на 1 мл; ФЭК с кюветами с толщиной слоя 1 см, миллиметровка.

Реактивы: биуретовый реактив.

 

Ход работы.

1. В первые 3 пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 5, 10 и 15 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения ка­либровочной кривой. В 4-ю пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую нужно опре­делить.

2. В каждую пробирку добавляют по 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для раз­вития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с толщиной слоя 1 см, пользуясь зе­леным светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе исполь­зуют биуретовый реактив.

3. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат - соответствующие значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.

Записывают принцип метода; зарисовывают калибро­вочный график зависимости оптической плотности от концентрации стандартного раствора белка. Пользуясь этим графиком, рассчитывают содержание белка в испы­туемом растворе и записывают результат.

 

 

Тема 3

ФЕРМЕНТЫ

(4 ч)

Работа 7. Ферменты как биологические катализаторы.

 

Ферменты, энзимы – специфические белки всех живых клеток, играющие роль биологических катализаторов. С их помощью осуществляется обмен веществ и энергии в организмах.

Свойства ферментов

1. Все ферменты белковой природы (простые и слож­ные).

2. Все ферменты характеризуются термолабильностью, т. е. оптимум дей­ствия 0°- 45°С.

3. Ферменты специфичны; различают абсолютную и от­носительную специфичность.

4. Ферменты действуют в мягких условиях среды, с определенным значением рН.

5. Ферменты обладают высокой каталитической актив­ностью (например, холинэстераза за 1 сек расщепля­ет 300000 молекул ацетилхолина).

 

Исследуемый материал: раствор слюны.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 15 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1% раствор крахмала, 2) 10% раствор NaOH, 3) 1% раствор CuSO4, 4) фосфатный буфер, 5) 1% раствор NaCl, 6) водный раствор I2 в КI.

 

Ход работы

Для исследования активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта ополаскивают водой) и доводят до метки 10 мл.

 

Опыт 1.Определение термолабильности амилазы слюны.

Реагенты, условия опытов Количество реагента, капель
Опыт А Опыт Б Контроль
Раствор слюны - -
Кипяченая слюна (кипятить 2 мл раствора слюны 5-8 мин, охладить) - -
Вода - -
Крахмал
Термостат, 38ºC, 10 мин
Реакция с иодом (5 капель раствора из пробирки + 1капля I2 в КI), окраска      
Реакция Троммера (5 капель раствора из пробирки + 5 капель 10% NaOH + 3 капли 1% CuSO4, кипятить 1 мин), окраска      
Вывод:

 

Опыт 2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции.

Реагенты, условия опытов Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4
Крахмал, мл
Раствор слюны, мл
Температура, ºC
Инкубировать 10 мин и затем добавить по 1-2 капли I2 в КI
Зарегистрировать окрашивание

 

 

Опыт 3. Определение оптимума рН для действия амилазы.

 

Условия опытов Реагенты Значение рН
6.0 6.4 6.8 7.2 7.6 8.0
Буферный раствор, мл
Крахмал, 0,5%, мл
Раствор слюны, мл
Термостат, 38ºC, 10 мин
Раствор I2 в КI, капель
Окраска            
Вывод:

 

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

 

Реагенты, условия опытов Количество реагента
Проба 1 Проба 2 Контроль
Раствор слюны, мл
Вода, капель - -
NaCl, капель - -
CuSO4 , капель - -
Крахмал, капель
Экспозиция, 5 мин
Раствор I2 в КI, капель
Результат, окраска      
Вывод:

 

Работа 8. Свойства ферментов

Исследуемый материал: раствор слюны, срезы клубней вареного и сырого картофеля.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1% раствор крахмала, 2) Феллингова жидкость, 3) 1% раствор сахарозы, 4) гваяковая настойка, 5) NaI (порошок), 6) NaCl (порошок), 7) КClO3 (порошок), 8) фильтрат дрожжей.

Ход работы

Опыт 1.Специфичность действия ферментов

Для действия ферментов характерна специфичность: а) абсо­лютная — фермент катализирует превращение строго определенного вещества (уреаза расщепляет только мочевину на СО2 и NH3); б) относительная — фермент катализирует превращения одного типа свя­зей в ряду близких по химическому строению веществ (например, липаза катализирует разрыв сложноэфирных связей независимо от типа радикала); в) групповая относительная — то же, но для разрыва связи важны образующие ее атомные группировки. Все протеолитические ферменты расщепляют пептидные связи, но пепсин, трипсин и химотрипсин расщепляют пептидные связи, образованные только определенными аминокислотами; г) стереохимическая — фермент катализирует превращение только одного стереоизомера при наличии рацемата (L-оксидазы превращают L-аминокислоты, но не D-аминокислоты).

 

Приготовить раствор слюны - 1мл слюны + 4 мл воды.

Реагенты, условия опытов Количество реагента, капель
Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4
Раствор слюны - -
Фильтрат дрожжей - -
Крахмал - -
Сахароза - -
Термостат, 37ºC, 10 мин
Реакция Феллинга (по 5 капель раствора из каждой пробирки+3 капли реактива Феллинга, кипятить 1 мин), окраска        
Вывод:  

 

 

Опыт 2. Исследование свойств фермента тирозиназы из картофеля.

Тирозиназа – фермент, окисляющий аминокислоту тирозин в темный пигмент за счет кислорода. Этот фермент может окислить и гвоякову смолу. В результате образуется озонид синего цвета.

Реагенты, условия опытов Срез сырого картофеля Срез вареного картофеля
Гваяковая настойка, капель
Результат    
Вывод      

 

Опыт 3. Ингибирующее действие хлорид-ионов на дегидрогеназный комплекс картофеля.

Хлорид-ионы ингибируют дегидрогеназный комплекс и в их присутствии поверхность среза картофеля остается без изменений; в остальных случаях она - темнеет.

 

Срезы клубней картофеля Нанесение порошка Результат, окраска (15-20 мин) Вывод
-    
NaCl  
NaI  
КClО3  

 

 

Тема 4

ВИТАМИНЫ

(8 ч)

 

Работа 9. Качественные реакции на витамины.

Витамины — это низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, необходимые для осуществления жизненно важных биохимических и физиологических процессов в живых организмах. При этом витамины не используются для пластических и энергетических нужд организма. Человек в сутки потребляет око­ло 600 г пищи (в пересчете на сухое вещество), из этого количества на долю витаминов приходится 100-200 мг. В настоящее время существует несколько номенклатур витаминов: 1) по предложению Э. Мак-Коллума (1913 г.), их обозначают латинскими буквами А, В, С, D, Е, К и др.; 2) наименование по физиологическому действию — к названию болезни, которую предупреждает или излечивает витамин, до­бавляется приставка aнmu- (антискорбутный, антигеморрагический, антистерильный и др.); 3) химическое наименование.

В 1974 г. принята временная классификация витаминов.

Витамины, растворимые в воде: В1 — тиамин, антиневротичес­кий; В2 — рибофлавин, витамин роста; В3 — пантотеновая кислота, антидерматитный; В5 (РР) — никотиновая кислота, антипеллагрический; В6 — пиридоксол, антидерматитный; В12 — цианкобаламин, антианемический; Вс — фолиевая кислота, антианемический; Н -биотин, антисеборейный; С — аскорбиновая кислота, антискорбут­ный; Р — рутин, капилляроукрепляющий.

Витамины, растворимые в жирах: А — ретинол, антиксерофтальмический; D — кальциферол, антирахитический; Е — токоферол, антистерильный; К — филлохинон, антигеморрагический;

Витаминоподобные вещества: холин, липоевая кислота, оротовая кислота, витамин В15, инозит, ПАБК (парааминобензойная кисло­та), карнитин, витамин U.

Биологическое действие большинства витаминов сводится к уча­стию их в ферментативных реакциях в качестве кофакторов фермен­тов (коферментная функция). Для витаминов, растворимых в воде, известны антивитамины. Это аналоги витаминов, которые оказывают противоположное витаминам действие (например, антивитами­ном тиамина является окситиамин). Среди жирорастворимых вита­минов антивитамины известны только к витамину К — производные кумарина (дикумарин, варфарин, тромексан).

Недостаточное поступление витаминов с пищей вызывает забо­левания, называемые гиповитаминозами. При отсутствии одного из витаминов в пище развивается авитаминоз, при недостатке несколь­ких — полигиповитаминозы, а при их отсутствии в пище — полиави­таминозы. При чрезмерном введении витаминов (как правило, жи­рорастворимых) могут развиваться гипервитаминозы.

 

Исследуемый материал: фармакопейные препараты витаминов А, С, Е, D, Р, В1, В6, В12, викасола.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, пробиркодержатель, спиртовка, спички, воронка, фильтровальная бумага, химический стакан, флюороскоп.

Реактивы:

1) H2SO4 (конц.), 23 % раствор хлороформа, 5 % раствор FeCl3;

2) анилиновый реактив (15 частей анилина и 1 часть HCl (конц.)), 23 % раствор хлороформа;

3) раствор цистеина — 0.25 г/л, раствор NaOH -100 г/л, раствор викасола — 0.5 г/л;

4) HNO3 (конц.), сахароза (порошок), 1%раствор FeCl3;

5) 10% раствор NaOH, 10% раствор HCl, 5% раствор K4[Fe(CN)6]; 1%раствор FeCl3, 0.01% раствор метиленового синего, 10% раствор Na2CO3, раствор Люголя (0.1% раствор иода в рас­творе йодистого калия);

6) 1% раствор FeCl3, рутин, насыщенный раствор, H2SO4 (конц.), 0.5% раствор HCl, феллингова жидкость, 10% раствор NaOH;

7) диазореактив - 5 капель 1% раствора сульфаниловой кислоты + 5 капель 5% раствор NaNO2, 10% раствор Na2CO3,

8) HCl (конц.), Zn (мет.);

9) 1%раствор FeCl3;

10) H2SO4 (конц.), 30% раствор NaOH, 10% раствор тиомочевины,.

 

Ход работы

Провести качественные реакции на витамины А, С, Е, D, Р, В1, В6, В12.

 

Опыт 1. Качественные реакции на витамин А.

Реакция на витамин А с концентрированной серной кислотой. В су­хую пробирку вносят 1 каплю раствора витамина А и 5 капель раствора хлороформа, перемешивают и добавляют 1 каплю концентрирован­ной серной кислоты. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Реакция на витамин А с хлорным железом. В сухую пробирку вно­сят 1 каплю витамина А и 5 капель раствора хлороформа. Перемешива­ют, добавляют 3 капли хлорида железа. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

 

Опыт 2. Качественные реакции на витамин D.

В сухую пробирку вносят 2 капли витамина D, 10 капель раствора хлорофор­ма и 1—2капли анилинового реактива, осторожно нагревают при постоянном помешивании. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Опыт 3. Качественная реакция на викасол.

К 5 каплям раствора викасола добавляют равное количество рас­твора цистеина и 1 каплю раствора едкого натра. Отмечают результат реакции.

 

Опыт 4. Качественные реакции на витамин Е.

Реакция с азотной кислотой. В сухую пробирку вносят 6 капель ви­тамина Е, добавляют несколько крупинок сахарозы. Осторожно по стенке пробирки прибавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Реакция с хлорным железом. В сухую пробирку вносят 0,5 мл ви­тамина Е, затем 0,5 мл раствора хлорного железа (III) и тщательно перемешивают содержимое пробирки. Отмечают результат реакции.

Опыт 5. Качественные реакции на витамин С.

Реакция с железосинеродистым калием K4[Fe(CN)6]. В две пробирки вносят по 1 капле раствора NaOH и по 1 капле раствора железосинеродистого калия. В одну пробирку добавляют 5 капель раствора вита­мина С, в другую — столько же воды. Перемешивают, добавляют по 3 капли раствора соляной кислоты и по 1 капле раствора хлор­ного железа. В пробирке с витамином С образуется осадок берлинской лазури, в контрольной пробирке наблюдается бурое окрашивание, обусловленное образованием железосинеродистой соли окиси железа.

Реакция с метиленовым синим. В две пробирки вносят по 1 кап­ле раствора метиленового синего, по 1 капле раствора соды. В одну из них добавляют несколько капель раствора аскорбино­вой кислоты, в другую — 1 мл воды. В пробирке с аскорбиновой кислотой происходит обесцвечивание метиленового синего (при нагревании).

Реакция с раствором Люголя. В две пробирки вносят по 10 капель дистиллированной воды и по 2 капли раствора Люголя. В одну про­бирку прибавляют 10 капель дистиллированной воды, в другую -10 капель раствора аскорбиновой кислоты. В пробирке с аскорбино­вой кислотой раствор Люголя обесцвечивается в результате восста­новления йода до йодистоводородной кислоты.

 

Опыт 6. Качественные реакции на витамин Р.

Реакция с хлоридом железа. Хлорид железа образует с рутином комплексное соединение, окрашенное в изумрудно-зеленый цвет. К 12 мл насыщенного водного раствора рутина прибавляют не­сколько капельраствора хлорида железа. Отмечают результат реакции.

Реакция с концентрированной серной кислотой. Концентрирован­ная серная кислота образует с флавонами и флавоноидами оксониевые соли, растворы которых имеют ярко-желтую окраску. На границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет кольцо. К 1 —2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по стен­ке пробирки добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Реакция с феллинговой жидкостью. При кислотном гидролизе рутина отщепляется молекула рутинозы, которая далее распадает­ся на глюкозу и рамнозу, обладающими восстанавливающими свой­ствами. К 0,5 г рутина добавляют 5 мл раствора соляной кислоты. Смесь доводят до кипения, кипятят в течение 1 мин, затем отфильт­ровывают. К полученному фильтрату приливают 3 мл раствора едкого натра и 3 мл феллинговой жидкости, нагревают до кипения. Отмечают результат реакции.

 

Опыт 7. Качественная реакция на витамин В1.

Диазореакция. В щелочной среде витамин В1 с диазореактивом обра­зует сложное комплексное соединение оранжевого цвета, которое образуется на границе двух жидкостей в виде кольца.К диазореактиву добавляют еще 1—2 капли раствора витамина В1. Затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5—7 капель раствора Na2CO3. Отмечают результат реакции.

Опыт 8. Качественная реакция на витамин В2.

Реакция восстановления витамина В2. Окисленная форма витамина В2 представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция на витамин В2 основана на его способности легко восстанавливаться; при этом раствор витамина В2, имеющий желтую окраску, приобре­тает сначала розовый цвет (за счет образования промежуточных со­единений), а затем обесцвечивается (восстановленная форма витамина В2 бесцветна).В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В2, добавля­ют 5 капель концентрированной соляной кислоты и опускают зер­нышко металлического цинка. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Начинается выделение пузырьков во­дорода, жидкость постепенно розовеет, затем обесцвечивается. Сравнивают обе формы витамина В2 по флюоресценции, поместив пробирку у флюороскопа.

Опыт 9 . Качественные реакции на витамин В6.

Реакция с хлоридом железа. Витамин В6 при взаимодействии с раствором хлорида железа (III) образует комплексную соль типа фено­лята железа красного цвета. К 5 каплямраствора витамина В6 приливают равное количе­ство раствора хлорного железа и перемешивают. Отмечают результат реакции.

Флюоресценция витамина В6. В пробирку вносят 10 капель рас­твора витамина. Поместив пробирку у флюороскопа, наблюдают го­лубую флюоресценцию.

 

Опыт 10. Качественная реакция на витамин В12.

При взаимодействии ионов кобальта с тиомочевиной при нагре­вании образуется роданид кобальта (II) зеленого цвета.Содержимое одной ампулы витамина В12 переливают в пробир­ку, добавляют 3 капли концентрированной серной кислоты и произ­водят сжигание до обесцвечивания в вытяжном шкафу! По оконча­нии минерализации осторожно добавляют в пробирку сначала 10 ка­пель воды, затем 10 капель раствора NaOH. Воду и щелочь добав­ляют осторожно при помешивании. На беззольный фильтр наносят 2—3 капли раствора тиомочевины и высушивают над плиткой. После этого наносят на фильтр 1—2 капли полученного минерализата и сно­ва нагревают над плиткой. На фильтре, чаще по краю пятна, появля­ется зеленое окрашивание, свидетельствующее о наличии кобальта.

 

Работа 10. Выделение и обнаружение фолиевой кислоты из дрожжей

Материалы для исследования: прессованные дрожжи

Оборудование: ступка с пестиком, песок, центрифуга, штатив с пробирками, химический стаканчик, стеклянная палочка, лакмусовая бумага, флюороскоп, фильтр, воронка для фильтрования.

Реактивы: 1) 0.1 н и 0.005 н растворы NaOH, 2) ледяная уксусная кислота, 3)0.4% KMnO4, 4) 3% раствор Н2О2

 

Ход работы

В ступку помещают 10 г дрожжей, добавляют 10 мл 0.1 н раствора гидроксида натрия, 2 г песка и растирают 5 мин. Затем центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Соблюдать все правила работы с центрифугой! Фильтруют. К 10 каплям над осадочной жидкости приливают 20 капель ледяной уксусной кислоты и 10 капель раствора перманганата калия так, чтобы розовое окрашивание не исчезало в течении 10 мин. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Через 10 мин удаляют избыток перманганата калия добавлением 4-5 капель раствора перекиси водорода и приливают 0.005 н раствор гидроксида натрия (приблизительно 5 мл) до рН 4.0 – 4.5. При ультрафиолетовом облучении фолиевой кислоты в щелочном растворе в флюороскопе наблюдается голубая флюоресценция.

 

 

Работа 11. Разделение смеси водорастворимых витаминов методом тонкослойной хроматографии

Материалы для исследования: раствор смеси витаминов: В1, В2, В5, В6, С в 50% растворе этанола.

Оборудование: хроматографическая камера, силуфоловые пластинки, капилляры, УФ лампа.

Реактивы: 1) подвижная фаза 1 (бензол – этанол - уксусная кислота - ацетон, 70:20:5:5),2) подвижная фаза 2 (бензол – этанол - уксусная кислота – ацетон, 55:35:5:5)

 

Ход работы

В угол силуфоловой пластинки на расстоянии 2 см от каждой стороны наносят раствор смеси витаминов. Проводят двухмерную хроматографию. Для первого направления используют подвижную фазу 1, затем подсушивают и проводят разделение в перпендикулярном направлении подвижной фазой 2. Затем пластины высушивают и выявляют пятна в УФ свете. Для выявления витаминов используют значения Rf с подвижной фазой 1: В1 – 0.00, В6 – 0.17, В2 – 0.48, В5 – 0.53, С – 0.68; с подвижной фазой 2: В1 – 0.00, В6 – 0.60, В2 – 0.16, В5 – 0.22, С – 0.44.

 

Работа 12.Количественное определение витамина Р (рутина) в черном и зеленом чае

Количественное определение рутина основано на его способности окисляться перманганатом калия. В качестве индикатора применяется индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом калия, после того как окисляется весь рутин. Экспериментально установлено, что 1 мл 0.05 н. раствора перманганата калия окисляет 3.2 мкг (0.00506 мкмоль) рутина. В черном чае содержится 300-500 мг/кг (474-790 мкмоль/кг) рутина, в зеленом — несколько больше.

 

Материал для исследования: различные сорта черного и зеленого чая.

Оборудование: весы, разновесы, 4 конические колбы на 50 мл, пинцет, мерный цилиндр, бюретки для титрования.

Реактивы: 1) 0,05 н. раствор KMnO4, 3) индикатор индигокармин;

 

Ход работы

К 0,1 г черного и зеленого чая приливают по 50 мл горячей дистил­лированной воды и проводят экстрагирование (перевод одного или нескольких компонентов из твердого пористого тала в жидкую фазу с помощью избирательного растворителя) в течение 5 мин. Отмерива­ют в конические колбочки по 10 мл экстракта, добавляют по 10 мл дистиллированной воды и 10 капель индигокармина. Титруют раствором перманганата калия до появления устойчивой желтой окраски. Расчеты производят по формуле

 

3,2(0,00506)·а·50·1000

Х = -------------------------------- (мкг(мкмоль)/кг)

10·0,1

где 3,2(0,00506) — количество рутина (мкг, мкмоль), соответствую­щее 1 мл 0,05 н. раствора перманганата калия; а — количество 0,05 н. раствора перманганата калия, израсходованное на титрование, мл; 10 — количество вытяжки, взятое для титрования, мл; 50 — общий объем экстракта, мл; 0,1 — масса сухого вещества, мг; 1000— коэффици­ент пересчета на 1 кг сухого вещества.

 

 

Работа 13.Количественное определение витами­на С методом йодометрического титро­вания

Аскорбиновая кислота является сильным восстано­вителем и может быть определена йодометрически при определенном значении рН раствора (например рН = 7). При титровании йодом аскорбиновая кислота окисляет­ся, образуя дегидроаскорбиновую кислоту.

 

Материал для исследования: капуста, картофель, лимон, яблоко;

Оборудование: 4 конические колбы на 50—100 мл, бюретка для титрования, терка, ступка с пестиком, фильтр, воронка для фильтрования, вата, толченое стекло или песок;

Реактивы: 2% раствор НС1, 0,5% раствор крахмала, 0,003 н. раство­р I2

 

Ход работы

Подготовка экстракта из пищевых продуктов для определения витамина С.

2 г капусты или картофеля натереть на терке в чаш­ке Петри или мелко порезать и растереть в ступке с не­большим количеством толченого стекла или песка. Затем, если измельчали на терке, собрать массу из чашки Петри в стаканчик, если в ступке — прямо в ступку добавить 10 мл раствора НС1. Хорошо перемешанную массу отфильтровать через стеклянную воронку с ватой в коническую колбу на 50—100 мл. Массу на ватном фильтре промыть несколькими каплями воды. В фильтрат прилить 1 мл раствора крахмала и титровать рабочим раство­ром I2 до появления синего окрашивания.

При расчете содержания витамина С в продукте ис­пользовать формулу определения массы при помощи тит­ра по определяемому веществу:

 

н · Э · V

М = -------------- (г), где

 

н - молярная концентрация эквивалента йода;

Э - молярная масса эквивалента аскорбиновой кисло­ты в г, равная в данном случае 88 г;

V — объем пошедшего на титрование йода, в мл.

 

Для пересчета на содержание витамина С в 100 г про­дукта использовать формулу:

 

М·1000

Х = ------------- (г)

Полученный результат сравнить с нормой: содержа­ние витамина С в капусте 45 мг, в картофеле — 20 мг (на 100 г растения).

 

 

Тема 5

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

(4 ч)

 

Работа 14. Выделение дезоксирибонуклеопротеина из ткани селезенки, печени, мышц.

Дезоксирибонуклеопротеины содержатся преимуще­ственно в ядрах клеток, в то время как рибонуклеопротеины преобладают в цитоплазме. Дезоксирибонуклеопротеины хорошо растворяются в щелочных и солевых растворах и выпадают в осадок при нейтрализации ще­лочных растворов и при разведении водой солевых рас­творов.

Исследуемый материал: ткани селезенки, печени, мышц курицы или рыбы.

Оборудование: ступка с пестиком, марля, центрифуга, штатив, пробирки, деревянные палочки, спиртовка, спички, воронка, 2 химических стакана, лакмусовая бумага, весы, разновесы, обратный холо­дильник, электроплитка.

Реактивы: 1) песок, 2) 1 М раствор NaCl, 3) 0,4% раствор NaOH, 4) 10% раствор H2SO4, 5) 10% раствор NH3, 6) дифениламин, 7) аммиачный раствор серебра, 8) реактив для биуретовой реакции, 9) 10% раствор уксусной кислоты, 10) молибденовый реактив.

 

Ход работы

3 г селезенки (печени, мышц) растирают в ступке с 0,6 г песка, затем небольшими порциями добавляют в ступку 1 М раствор хлористого натрия, растирая содержимое в течение 15— 20 мин.

Полученный вязкий раствор процеживают через мар­лю в химический стакан, переносят в центрифужные пробирки, урав­новешивают их и центрифугируют в течение 10—15 мин. Соблюдать все правила работы с центрифугой! Измеряют объем полученного центрифугата, отмеряют 5-кратный объем воды (по отношению к центрифугату), подкисленный уксусной кислотой до рН = 4.5, в стакан и, медленно вращая в нем деревянную палочку, вливают цен­трифугат.

Нерастворимый в воде дезоксирибонуклеопротеин выпадает в осадок и наматывается в виде нитки на дере­вянную палочку. Нити дезоксирибонуклеопротеина вы­нимают вместе с палочкой и переносят в чистую пробир­ку. Эту часть дезоксирибонуклеопротеина используют для обнаружения дезоксирибозы дифениламиновой пробой. Для этого содержимое пробирки растворяют в 10 каплях раствора гидроксида натрия и прибавляют 10 капель дифениламинового реактива. После 10-минугного нагревания в кипящей водяной бане жидкость в пробирке приобрета­ет синее окрашивание.

Остальную часть выделившегося в виде осадка нуклеопротеина отделяют центрифугированием, переносят и пробирку, прибавляют 5 мл раствора серной кис­лоты и закрывают пробирку пробкой с обратным холо­дильником. Осторожно нагревают пробирку в течение часа, держа ее на расстоянии от спирали электроплитки. Время нагревания отмечают с момента закипания рас­твора.

Гидролизат после охлаждения отфильтровывают и проводят ряд реакций. Белок и полипептиды обнаружи­вают биуретовой реакцией. Для обнаружения пуриновых оснований к 1 мл гидролизата прибавляют 5—6 капель раствора аммиака до щелочной реакции по лакмусу и до­бавляют 0,5 мл аммиачного раствора серебра. Образуется хлопьевидный осадок серебряных солей пуриновых осно­ваний, который постепенно оседает на дно.

Фосфорную кислоту обнаруживают фосфорно-молибденовой пробой по появлению желтого осадка фосфорно-молибденовокислого аммония. К 0,5 мл гидролизата прибавляют равный объем мо­либденового реактива и кипятят несколько минут. Жид­кость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаж­дении образуется желтый осадок фосфорно-молибденовокислого аммония.

 

 

Работа 15. Извлечение нуклеопротеинов дрожжей

Для изучения химического состава нуклеопротеинов удобно пользоваться дрожжевыми клетками. При непро­должительном гидролизе дрожжевой массы или выделен­ных из нее нуклеопротеинов, последние (нуклеопротеины) распадаются на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу и дезоксирибозу и фосфорную кислоту. Продукты гидролиза могут быть обнаружены в гидролизате качественными для каждого вещества ре­акциями.

 

Исследуемый материал: прессованные дрожжи.

Оборудование: ступка с пестиком, марля, центрифуга, штатив, пробирки, деревянные палочки, спиртовка, спички, воронка, 2 химических стакана, лакмусовая бумага, стеклянный песок.

Реактивы: 1) диэтиловый эфир, 2) 0.4%-го раствор NaOH, 3) 10% уксусная кислота.

 

Ход работы

Извлечение нуклеопротеинов из дрожжей. В фар­форовую ступку помещают 1 г дрожжей, добавляют 1 каплю диэтилового эфира, 2 капли дистиллированной воды, около 0,1 г стеклянного песка. Дрожжевую массу растирают пестиком 1—2 мин для разрушения клеток. В ступку добавляют 4 мл раствора гидроксида натрия и растирание продолжают в течение 5 мин. Содержимое ступки пипеткой переносят в центрифужную пробирку, уравновешивают на весах с другой пробиркой, в которую налита вода, и центрифугируют в течение 10 мин. Надосадочную жидкость переносят пипеткой в стакан с 80—90 мл воды, подкисленной до рН = 4.5 уксусной кислотой. Выпавший осадок РНК-протеина отделяют центрифугированием.

 

 

Работа 16. Изучение химического состава рибонуклеопротеинов дрожжей

Исследуемый материал: прессованныедрожжи

Оборудование: коническая колба 150 мл, ступка с пестиком, марля, центрифуга, штатив, пробирки (маленькие и большие), деревянные палочки, спиртовка, спички, воронка, 2 химических стакана, лакмусовая бумага, весы, разновесы, водяная баня, обратный воздушный холодильник.

Реактивы: 1) 10% раствор H2SO4, 2) 10% раствор NaOH, 1 % раствор CuSO4, 3) 10% раствор NH3, 4) аммиачный раствор серебра, 5) мо­либденовый реактив.

Ход работы

200 мг дрожжей помещают в широкую пробирку и добавляют 5 мл 10%-го раствора серной кислоты и 5 мл дистиллированной воды. Перемешивают и закрывают пробкой с обратным воздушным холодильником. Пробир­ку помещают на кипящую водяную баню и кипятят при слабом нагревании 1 час. Затем пробирки охлаждают, фильтруют содержимое и с гидролизатом проводят реакции на составные части нуклеотидов.

А) Биуретовая реакция на белок.

К 5—6 каплям гидролизата прибавляют 10 капель 10% -го раствора NaOH и 1 каплю 1 % -го раствора медного купороса. При наличии белка жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

Б) <