Эмбриологические аспекты экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона (ЭКО и ПЭ).
Эмбриология
Эмбриология – наука о жизни до рождения.
Первые сведения о развитии зародыша человека в Древней Индии, Древней Греции
в VIII – VI в. до н.э.
Гиппократ «О семимесячном плоде», «О сверхоплодотворении»,
«О природе ребенка»
Леонардо да Винчи – один из основателей эмбриологии, как точной науки.
«Вены ребенка развиваются не в веществе матки его матери, но в плаценте, которая служит как бы сорочкой, одевающей матку изнутри и связана с ней с помощью ворсинок»
Петр I издал указы, предписывающие нежизнеспособных уродов птиц, зверей и человека сдавать в аптеки или коменданту города.
В 1718 г. возникла коллекция Кунсткамеры.
Карл Рейхерт в 1873 году впервые описал зародыш человека в очень раннем возрасте 12 – 13 дней и сделал зарисовки.
Прогенез.
Яйцеклетка, строение, классификация. Яйцеклетка женщины, трубный период развития.
· Ядро, ядрышко. Гаплоидный набор хромосом.
· Цитоплазма, органеллы, много РНК, отсутствует клеточный центр.
· Включения желтка – фосфо- и липопротеины.
· Кортикальные гранулы – производное комплекса Гольджи.
· Мультивезикулярные тельца – производные лизосом.
Типы яйцеклеток
· Алецитальные – не содержит желтка, окружены желточными клетками (беспозвоночные, например, плоские черви).
· Изолецитальные (гр.iso – ровно, однородно), олиголецитальные – желтка мало, равномерно в цитоплазме.
§ а) первично изолецитальные (хордовые, например ланцетник).
§ б) вторично изолецитальные (млекопитающие).
· Телолецитальные (telos – конец), полилецитальные – желтка много, у одного конца (вегетативного полюса), у другого анимального полюса – ядро и органеллы.
§ Умеренно телолецитальные (амфибии).
§ Резко телолецитальные (костистые рыбы, пресмыкающиеся, птицы).
· Центролецитальные – желток в центре клетки вокруг ядра (насекомые).
Яйцеклетка женщины – вторично изолецитальная.
Диаметр 120-130 мкм.
Две дополнительные оболочки:
§ zona pellucida – блестящая оболочка (гликопротеид Zp3 – рецептор для сперматозоидов);
§ corona radiatа – лучистый венец.
Трубный период развития.(около 5 суток)
После овуляции овоцит II порядка захватывают фибрии маточной трубы. В трубе происходит:
• Второе деление мейоза и образование из овоцита II порядка яйцеклетки;
• Оплодотворение;
• Дробление.
Важнейшую роль играет слизистый секрет маточных труб.
Яйцеклетка способна к оплодотворению в течение 1-х суток, жизнеспособна – 2 суток.
Строение сперматозоида, концентрация, подвижность, изменения в женских половых путях.
Описал А. Левенгук в 1677 г.
Длина у человека около 70 мкм.
Две части:
· Головка;
· Хвост.
Головка.
· Ядро с гаплоидным набором хромосом, очень плотно упакованных.
· Ядерные белки не гистоны, а богатые аргинином и цистеином – за счет них плотная упаковка.
· В конденсированном состоянии генетический материал защищен от повреждений.
· Акросома – спереди от ядра уплощенный пузырек, производное комплекса Гольджи. Содержит ферменты, необходимые для проникновения сперматозоида в яйцеклетку.
В хвосте 4 части.
· I - шейка
· II – промежуточная
· III - основная
· IV – концевая часть.
Шейка содержит 2 центриоли.
· От проксимальной центриоли отходит аксонема, которая имеет строение реснички
· (9x2)+2
· Дистальная центриоль кольцевидной формы
Промежуточная часть.
· Митохондрии, расположенные по спирали
· Вокруг аксонемы
Основная часть.
· Аксонема.
· Вокруг волокнистая оболочка (тонкофибрильное влагалище).
Концевая часть.
· Аксонема.
· Покрыта непосредственно плазмолеммой.
ü Концентрация сперматозоидов в норме 20-200млн в мл спермы
ü Меньше – олигоспермия, мужское бесплодие.
ü 15% супружеских пар страдают бесплодием
ü 50% - мужское бесплодие!
Подвижность сперматозоидов в среднем 83%.
Приобретают подвижность в семявыносящих путях
• Сеть семенника – 0,3 – 0,6%
• Головка придатка – 7%
• Хвост – 40%
ü Важнейшее значение играет секрет простаты – «второе сердце мужчины»
· Скорость движения сперматозоида – 2-3 мм/мин
· Путь до яичника 30 см преодолевает за 1,5 – 2 часа.
· Подвижность сохраняет до 5 сут., к оплодотворению способны 2 сут.
В кислой среде влагалища сперматозоид погибает через 2,5 часа.
В маточных трубах оптимальная среда:
· Капацитация (активизация) – увеличение подвижности, потребление кислорода, изменения в цитолемме.
· Фагоцитоз неполноценных сперматозоидов, в норме до 10-50 %.
Эмбриогенез человеказанимает 10 лунных (28 дней) или 9 календарных месяцев.
Периоды эмбриогенеза.
· Начальный – 1-ая неделя; оплодотворение, дробление.
· Зародышевый – 2-8 неделя; гаструляция и закладка осевых зачатков органов – 2-3 неделя;
гисто – органогенез – 4-8 неделя.
· Плодный – с 3-го месяца до рождения.
Оплодотворение.
Слияние мужской и женской половых клеток с образованием одноклеточного организма – зиготы.
3 фазы:
· Сближение и дистантное взаимодействие.
o Пассивное движение яйцеклетки с током жидкости по яйцеводу.
o Активное движение сперматозоидов.
§ Отрицательный реотаксис – против тока жидкости.
§ Хемотаксис – по градиенту концентрации гиногамонов, выделяемых яйцеклеткой.
§ Электротаксис – электрическое взаимодействие между гаметами.
· Контактное взаимодействие гамет.
o Связывание гамет – множество сперматозоидов связывается с зернистой оболочкой яйцеклетки.
o Акросомная реакция – активизация ферментов акросомы, удаление фолликулярных клеток (денуация).
o Прикрепление к плазмолемме – один сперматозоид преодолевает оболочки, прикрепляется к плазмолемме. Выпячивание цитоплазмы – бугорок оплодотворения.
· Проникновение сперматозоида в яйцеклетку
o Головка и шейка (ядро и центриоли) одного сперматозоида проникают в яйцеклетку (моноспермия).
o Кортикальная реакция – кортикальные гранулы опорожняются в пространство между плазмолеммой и блестящей оболочкой.
o Блестящая оболочка уплотняется, образует оболочку оплодотворения, не пропускающая другие сперматозоиды.
o Сближение ядер – стадия двух пронуклеосов (12 часов).
o Слияние ядер – образование синкариона.
o Сразу начинается первое деление («материнская звезда» в метафазе).
Дробление.
· Ряд митотических делений без последующего увеличений дочерних клеток (бластомеров) до массы материнских. В интерфазе отсутствует G1-период.
· В результате дробление образуется бластула.
· Тип дробления зависит от количества и распределения желтка.
Ланцетник (яйцеклетка первичная изолецитальная).
· Дробление полное, равномерное, синхронное.
· Образуется целобластула.
Амфибии (яйцеклетка умеренно телолецитальная).
· Дробление полное, неравномерное, асинхронное.
· Амфибластула.
Птицы (яйцеклетка резко телолецитальная).
· Дробление неполное.
· Дискобластула.
Человек (яйцеклетка вторично изолецитальная).
· Дробление полное, асинхронное.
· Стадии 2,3,4,5,6,8,9,12,16 до 107 бластомеров.
· Неравномерное, неравноценное.
Два типа бластомеров.
· В центре – крупные темные бластомеры образуют эмбриобласт (зародыш).
· Снаружи – мелкие светлые образуют трофобласт (гр. trophe – пища).
ü Вначале зародыш имеет вид тутовой ягоды – морула
ü Затем появляется полость с жидкостью – бластоциста
ü На 5 сутки ХЭТЧИНГ – выклев бластоциста выходит из zona pellucida, попадает в матку.
Близнецы.
ü Первые бластомеры могут давать самостоятельные организмы (8 бластомеров) – однояйцевые близнецы.
ü Оплодотворение нескольких яйцеклеток – разнояйцевые близнецы.
«Погасите свечу, они выходят на свет»!!!
ü В 1755г. крестьянин села Введенского Яков Кириллов 60 лет был представлен ко двору. Первая жена родила 57 детей (4х4 + 7х3 + 10х2), вторая – 15 детей (1х3 + 6х2). Всего 72 ребенка.
ü 1782г. 27 февраля была прислана ведомость в Москву он Никольского монастыря Шуйского уезда. Федор Васильев 75 лет женатый 2 раза имел 87 детей.
Закономерность.
ü На 87 обычных родов – одна двойня.
ü На 87 двоен – одна тройня.
ü На 87 троен –рождение 4-х близнецов, 1/3 однояйцевые.
Имплантация (Нидация).
· Внедрение зародыша в эндометрий
· Начинается на 7 сутки, длится 40 часов
· 1 стадия. Адгезия (прилипание) – с помощью трофобласта зародыш прикрепляется к эндометрию.
· 2 стадия. Инвазия (проникновение).
o Трофобласт диффиринцируется на 2 слоя.
§ Цитотрофобласт .
§ Симластотрофобласт.
Симпластотрофобласт выделяет ферменты, разрушающие эндометрий.
Зародыш погружается в толщу эндометрия, дефект регенерирует.
Питание зародыша.
o В начале гистеотрофный тип – за счёт разрушенных тканей эндометрия;
o Затем гематотрофный тип – за счёт материнской крови.
Эмбриологические аспекты экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона (ЭКО и ПЭ).
Около 15 % супружеских пар бесплодны.
Мужское и женское бесплодие 50:50 %.
· Метод разработали англичанине: эмбриолог Роберт Эдвардс и гинеколог Патрик Стептоу.
· Первый «пробирочный» ребёнок родился в Англии в 1978 году - (в России в 1986 году).
· В 1907 году русский исследователь Груздев В.С. проводил опыты на кроликах. Забирал из яичников яйцеклетки, смешивая их со сперматозоидами, и вводил в яйцеводы.
Показания для ЭКО.
· Абсолютное женское бесплодие: полная непроходимость или отсутствие маточных труб.
Этапы ЭКО.
· Исключение мужского фактора бесплодия.
· Обследование женщины.
o Гормональный статус (ФСГ, ЛГ, пролактин, тестостерон, эстродиол и др.).
o Инфекции, передаваемые половым путём.
o Ультразвуковое исследование.
o Томография головного мозга (гипофиз).
o Лапороскопия и гистероскопия (наиболее информативные методы).
· Стимуляция суперовуляции.
o Стимуляция фолликулогенеза препаратами ФСГ.
o Введение в средине цикла овуляторной дозы хорионического гонадотропина (ХГ) - аналога лютеотропного гормона (ЛГ).
· Трансвагинальная пункция и аспирация овоцитов (8-10 овоцитов) через 36 часов после введения овоцитов ХГ.
· Перенос овоцитов в культуральную среду. Оценка качества овоцитов под микроскопом (критерии степени зрелости: наличие одного полярного тельца, состояние cumulus, corona radiata и др.) .
· Отбор зрелых овоцитов.
· Обработка спермы, градиентное центрифугирование с целью отбора фракции наиболее фертильных (активных) сперматозоидов.
· Оплодотворение.
o Добавление в культаральную среду спермы, не менее 50 тыс. подвижных сперматозоидов на 1 овоцит.
o Оптимально через 4 часа после появления одного полярного тельца.
· Культивирование в среде 2 суток (общепринято)
o Дробление: от 2-4 до 6-8 бластомеров.
· Оценка качества зародышей под микроскопом
· Трансвагинальный перенос 2-3 зародышей в матку.
o Остальных зародышей консервируют в жидком азоте.
Вероятность наступления беременности не более чем в 30% на одну попытку
Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида.( ИКСИ-метод )
· Показание: мужское бесплодие (олигоспермия, азооспермия – полное отсутствие эякулята и др.).
· Впервые беременность после ИКСИ получена в 1992 году в Бельгии.
· До этого использовалась донорская сперма.
· При отсутствие эякулята производят пункцию:
o Придатка
o Яичка
· Биоптат помещают в культуральную среду.
· Выбирают 1 нормальный, подвижный сперматозоид.
Оборудование.
· Инвертированный микроскоп на антивибрационном столе
· Два микроманипулятора
· Стеклянные микроинструменты:
o Присоска для яйцеклетки
o Микроигла для сперматозоида.
Этапы.
· Иммобилизация сперматозоида – перетирание хвоста микроиглой о дно чашки.
· Засасывание сперматозоида, первым в пипетку заходит хвост.
· Ориентация и закрепление ооцита на присоске - полярное тельце на 12 или 6 часов (под ним метафизарная пластинка).
· Прокол ооцита на 3 часа – наименьшее повреждение генетического материала (метафизарной пластины)
· Инъекция сперматозоида
· Далее по программе ЭКО и ПЭ.
Донация ооцитов.
Показания: Отсутствие яичников или нефункционирующие яичники.
· Оплодотворяется донорская яйцеклетка по программе ЭКО, зародыш переносится в матку
· Дети генетически чужеродные для родивших их матерей.
· Перед пересадкой зародыша проводятся заместительная гормонотерапия, т.к. у женщины без яичников происходит уменьшение размеров матки и атрофия эндометрия.
· В течение 2-4 месяцев назначаются препараты эстрогенов и прогестерона согласно фазам менструального цикла.
Гаструляция (лат. gaster – желудок).
Процессы размножения, перемещения и дифференцировки клеток, в результате которых образуются зародышевые листки (эктодерма, мезодерма, энтодерма). Зародыш становится многослойным.
Способы гаструляции:
· Инвагинация (ланцетник).
· Эпиболия (амфибии).
· Иммиграция (птицы, млекопитающие).
· Деламинация (высшие позвоночные).