Программа амплификации
"Классическая" программа амплификации включает следующие этапы:
— первоначальный прогрев реакционной смеси;
от 20 до 40 циклов, каждый из которых состоит из денатурации молекулы ДНК, отжига праймеров, элонгации (удлинения) получающихся цепей (см. рис. В.9). Количество циклов амплификации и продолжительность каждого зависят от конкретной задачи, размера получаемых ампли- конов и используемого фермента;
— окончательная достройка цепей ДНК;
— охлаждение полученных проб и их хранение в термоциклере при пониженной температуре (4—10°С).
Первоначальный прогрев реакционной смеси. Обычно перед началом реакции смесь прогревают при 90—95°С в течение 1—5 мин. Это делается для полной денатурации матрицы и праймеров, лучшего перемешивания компонентов смеси, для выравнивания температуры всех узлов (термоблок, пробирка, смесь). Первоначальный прогрев обязателен, когда для старта реакции необходимо расплавить парафиновую прослойку в пробирке, которую часто используют для разделения компонентов готовых тест-систем для ПЦР.
Циклы ПЦР. Обычно проводят 25—35 циклов, каждый из которых включает денатурацию, отжиг и элонгацию (см. рис. В.9).
Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 90—95°С на 10—60 с, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Если фиксация температуры проводится по датчику в пробирке, то необходимо следить за тем, чтобы объем жидкости в пробирке с датчиком соответствовал объему смеси в экспериментальных пробирках.
Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5°С ниже температуры плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей и снижению эффективности ПЦР (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).
Удлинение цепей ДНК (элонгация). В стадии элонгации ДНК-полимераза достраивает матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3' конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу синтезируемого ампликона. Температура элонгации зависит от полимеразы. При использовании Taq-полимеразы обычно используют температуру 68—72°С. Однако фермент хорошо работает и при более низких температурах. Если температура отжига более 60°С, то можно просто увеличить время отжига и сделать цикл двухстадийным. Это позволит ускорить прохождение ПЦР (а значит, и дольше сохранить активность полимеразы). Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амилифицируемого фрагмента. Обычно считается, что скорость работы фермента составляет 50—100 нуклеотидов в секунду, в связи с чем время элонгации принимают равным 15—60 с для фрагментов разной длины.
Окончательная достройка цепей. После окончания всех циклов проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.
Хранение пробирок в приборе после І1ЦР. После прохождения ПЦР пробирки с продуктом охлаждают до температуры 4—10°С и хранят в этих условиях в течение нескольких часов до извлечения из аппарата. Это помогает снизить отрицательные последствия (разрушение ампликонов) от возможной примеси разрушающих ДНК термостабильных ДНКаз [1] в реакционной смеси.
Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2п —2л, где п — число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла меньше 100%, поэтому в действительности
Р-(1 +E)n,
где Р — количество продукта; Е — средняя эффективность цикла (лежит в диапазоне от 0 до 1 и изменяется для разных циклов программы).
Число "длинных" копий ДНК тоже растет, но линейно (2n), поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.
Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется ("эффект плато").