Иммунохроматография

Для экспресс-анализа фитопатогенов используют методы иммунохроматографического анализа, или устройства с "латеральным потоком" (Lateral Flow Assay, LFA). Часто их называют "тест-полоски". На тест- полоске последовательно расположены:

— зона нанесения образца ("фильтрующая мембрана");

— мембрана с антителами (специфичными к определяемому антигену), мечеными частицами окрашенного латекса или коллоидного золота Аи ("мембрана с конъюгатом");

- нитратцеллюлозная мембрана с участком специфичных к определяемому антигену антител ("аналитическая линия") и с участком антивидовых антител, которые связываются с участками меченых антител, характерными для того животного, в котором они были получены ("контрольная линия");

поглощающая зона из впитывающего материала (рис. 5.4).

Рис. 5.4. Устройство тест-полоски (по А. Н. Блинцову, Ю. Ф. Дрыгину)

Схема работы иммунохроматографического экспресс-теста Вперед. Исследуемый образец растирают в специальном буферном растворе, твердым частицам дают осесть в течение нескольких минут. Надосадочную жидкость наносят на фильтрующую мембрану, после чего на "мембране с конъюгатом" она смешивается в определенной пропорции с конъюгатом — специфичными к определяемому антигену антителами, связанными с окрашенными частицами латекса или коллоидного золота. Частицы образовавшегося комплекса "антиген — меченый конъюгат" двигаются с током жидкости вдоль нитроцеллюлозной мембраны, в определенном месте которой ("аналитическая линия") находятся другие антитела, также специфичные к антигену. Молекулы этих антител связывают частицы движущегося комплекса, в результате чего в тестовой зоне концентрируются окрашенные частицы и образуется видимая глазом полоса, свидетельствующая о наличии определяемого возбудителя в образце. Когда комплекс "антиген — меченый конъюгат" достигает "контрольной линии", на ней происходит связывание всех достигших ее меченых антител (как свободных, так и в комплексе с антигенами). Появление видимой полосы около "контрольной линии" свидетельствует о том, что миграция образца вдоль мембраны произошла нормально, следовательно, анализ выполнен правильно и его результат достоверен. Таким образом, о положительном результате говорит наличие двух полос, а в случае отсутствия выявляемого фитопатогена в образце появляется только одна (контрольная) полоса, свидетельствующая, что тест работает.

На мембране комбинированных тест-полосок, предназначенных для определения нескольких возбудителей одновременно, антитела разной специфичности присутствуют в нескольких тестовых зонах (т.е. присутствуют несколько "аналитических линий"), соответственно, в результате анализа может окраситься несколько тестовых полос, обычно разного цвета, соответствующих присутствующим в образце возбудителям.

Идентификация бактерий и грибов по составу жирных кислот

Компания MIDI (Microbial Identification Inc., USA) ^[1] предлагает автоматизированный метод идентификации бактерий по составу жирных кислот. Идентификация бактерий по составу эфиров жирных кислот с помощью газо-жидкостной хроматографии используется уже более 50 лет. В бактериях найдено более 300 жирных кислот и родственных им компонентов. Тип продуцируемых жирных кислот и относительные концентрации индивидуальных жирных кислот строго зависят от генотипа и являются характерными для того или иного вида микроорганизма или даже его штамма. Анализ жирных кислот клетки позволяет дифференцировать и идентифицировать роды, виды и штаммы различных бактерий, микобактерий и дрожжей, включая фитопатогенные.

На композицию жирных кислот влияют условия культивирования: состав сред, температура и время инкубации. Тем не менее, если данные условия культивирования поддерживают постоянными, количественный и качественный состав жирных кислот оказывается хорошо воспроизводим, стабилен и консервативен. Чтобы стандартизировать условия выращивания, MIDI используют автоматизацию процесса. После выращивания и подготовки образцов система с помощью хроматографии автоматически определяет состав комплекса жирных кислот в клетках исследуемых организмов, после чего сравнивает его с профилем жирных кислот известных микроорганизмов, хранящихся в базах данных. В настоящее время фирма предлагает две системы идентификации: одну для бактерий и дрожжей с базой данных, содержащей информацию о более чем 1500 видах; и другую — для микобактерий, позволяющую определять 25 видов микобактерий и 35 видов других организмов. В базы данных включены сведения о составе комплекса жирных кислот при разных условиях выращивания. Анализ проводится очень быстро: время подготовки проб, анализа жирных кислот и компьютерной обработки в сумме занимает не более 15—30 мин.