Выделение чистых культур
Определить возбудителя по мицелию или по конидиальному спороношению (которого может и не быть) не всегда представляется возможным. В определителях используются, например, и такие признаки, как форма и цвет колонии, выросшей на определенной среде. Поэтому в большинстве случаев для правильного видового определения необходимо выделение микробиологически чистой культуры гриба.
Для выделения чистой культуры необходимо получить чистые, незагрязненные субстратом, почвой, другими грибами или бактериями конидии или мицелий интересующего гриба. В только что собранных пораженных растительных образцах их найти обычно сложно. Поэтому, как правило, для выделения берут субстрат после инкубации во влажной камере. При этом во время инкубации во влажной камере можно создать селективные условия, способствующие росту и конидиеобразованию интересующего патогена. Например, если надо выделить возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans, то температуру инкубирования влажной камеры надо установить на 16—18°С. При такой температуре уже через 8—16 часов появятся зооспорангии Phytophthora infestans, в то время как другие грибы только начнут активный рост. Если же мы с того же образца хотим выделить грибы рода Altemaria, то температуру инкубации надо поднять до 25°С - это оптимум роста для этой группы грибов. Некоторые фитопатогенные бактерии инкубируют при температуре 30°С и выше.
Для выделения чистых культур понадобится микроскоп (лучше — бинокулярный, например, МБС-10 или аналогичный), остро заточенная препаровальная игла, горелка и чашки Петри со стерильной агаризованной селективной средой. Для выделения большинства грибов из отделов аскомицеты и базидиомицеты подойдет среда на основе пивного сусла. Однако оомицеты на такой среде не растут, для их выделения обычно используют овсяную, гороховую или ржаную агаризованную среду.
Рекомендации
Состав среды для выделения аскомицетов и базидиомицетов:
— неохмеленное пивное сусло плотностью 15 баллингов — 150 г;
— вода — до 1 л;
— агар-агар — 15 г.
Приготовление:
компоненты смешать, разлить по колбам, добавить агар-агар и автоклавировать 30 мин при 1 атм (12ГС).
Состав гороховой среды для выявления оомицетов:
— мороженый зеленый горошек — 200 1“
— морковь — 30 г;
— агар-агар — 15 г.
Приготовление:
морковь нарезать мелкими кубиками, вместе с горохом кипятить 10 мин. Отвар процедить и смешать с агар-агаром. Автоклавировать 30 мин при 1 атм.
Для того чтобы сделать среду селективной, в нее перед розливом по чашкам Петри добавляют антибиотики и (или) фунгициды, которые будут препятствовать росту нежелательных бактерий и грибов. Если выделение проводится с корнеплодов или загрязненных почвой частей растений, то в среду полезно добавить небольшое количество инсектицида или акарицида (например, препараты "Актара", "Регент" или др.), так как из почвы в чашку часто попадают клещи. Все антибиотики, фунгициды, акарициды и инсектициды следует добавлять только после того, как среда остынет до 60°С.
Для выделения бактерий используют другие среды, например LB.
Рекомендации
Состав среды LB:
— триптон — 10 г;
— дрожжевой экстракт — 5 г;
— NaCl - 10 г;
— вода дистиллированная — до 1 л;
— агар-агар — 15—20 г.
Приготовление:
компоненты смешать, разлить по колбам, добавить агар-агар и автоклавировать 20 мин при 1 атм. Оптимальный pH — 7,0.
Процедура выделения в чистую культуру Вперед. После появления мицелия и (или) спороношения образец помещают под бинокулярный микроскоп. Под микроскопом находят интересующий конидиеносец, мицелий, плодовое тело или скопление бактерий. Конец остро заточенной препаровальной иглы прокаливают докрасна над пламенем горелки и охлаждают, окуная в агаризованную среду в стерильной чашке Петри. Охлаждать иголку и открывать чашку надо аккуратно, около горелки, чтобы не нарушить стерильность. Охлажденной иголкой, конец которой стал липким от налипшего агара, снимают с конидиеносца одну или несколько конидий и переносят их в центр чашки Петри. Инокулированные чашки Петри помещают в термостат, где поддерживается оптимальная для роста выделенного объекта температура.
При выделении чистых культур из воды, почвы, гнилых корнеплодов и т.д. часто используют метод приманок. Он заключается в том, что па поверхность хорошо увлажненного субстрата (или воды) помещают орган растения, поражаемого тем организмом, который хотят выделить. Так, для выделения из воды оомицетов рода Phytophthora в качестве приманки хорошо подходят листья рододендрона, для выделения Phytophthora infestans из почвы используют листья картофеля или томата восприимчивых сортов, для выделения из почвы возбудителя черной корневой гнили Thielaviopsis basicola — ломтики моркови. После появления на приманке симптомов поражения ее помещают во влажную камеру и выделяют чистую культуру, как описано выше (рис. В.З; В.4).
Через несколько суток инкубации (зависит от вида выделяемого гриба и температуры инкубации) инокулированные чашки Петри со средой надо просмотреть. Если на чашке виден рост интересующего объекта и других
организмов, то процедуру выделения надо повторить, только вместо пораженного субстрата под бинокуляр помещают чашку Петри. Остро заточенной иглой на другую чашку переносят конидии, гифы или кусочек мицелия с гифами интересующего объекта. Иногда такую процедуру чистки повторяют несколько раз. Очистку прекращают после того, как в чашке Петри будет расти только колония того объекта, который требовалось выделить в чистую культуру (рис. В.5).
Следует отметить, что в работе со спорулирующими (т.е. образующими споры) грибами неприемлемо использование ламинарных боксов с включенным продувом, так как движущийся воздух сдувает споры и распространяет их по всему помещению. Со спорулирующими грибами можно работать только в неподвижном воздухе.
Чистую культуру выделенного гриба или бактерии можно идентифицировать с помощью определителей или выделить из нее ДНК и анализировать с помощью ПЦР и секвенирования участков генома.
С практической точки зрения чистые культуры интересны еще и тем, что их можно подвергнуть разным видам анализа, например, изучить их вирулентность к выращиваемым или планируемым к введению в севооборот сортам.
Другой важный показатель, который можно оценить на чистых культурах фитопатогенов (особенно грибов и оомицетов), — устойчивость к фунгицидам. В результате оценки можно подобрать наиболее эффективные препараты. На рис. В.6 приведен пример тестирования чистых культур гриба Rhizoctonia solarti, выделенного из картофеля, на устойчивость к фунгициду пенцикурон (входит в состав широко применяемого фунгицидного протравителя семенных клубней "Престиж"). Из рисунка видно, что чувствительный изолят (сверху) не растет даже на минимальной концентрации в 0,1 мг/л, в то время как устойчивый (снизу) растет даже па 100 мг/л. Если среди выделенных с поля изолятов доля устойчивых превышает 5%, то применять на данном ноле фунгицид не имеет смысла.
Для того, чтобы доказать, что выделенный гриб — именно патоген, а не сапротроф, случайно выросший на пораженной некротизированной ткани, принято проводить исследования в соответствии с триадой Коха, которая гласит:
1. Микроорганизм постоянно встречается в организме больных растений и отсутствует у здоровых.
2. Микроорганизм может быть изолирован из больного растения.
3. При заражении чистой культурой микроорганизма здоровый организм заболевает.
При работе всегда следует помнить, что далеко не все фитопатогенные объекты проявляются при визуальном осмотре, во влажных камерах или растут на среде. Так, не удается культивировать па среде возбудителей ржавчины, мучнисторосяные, некоторые головневые грибы, фитоплазмы, вирусы и многие другие живые объекты. Поэтому велика вероятность того, что истинный источник заболевания останется неизвестным, а проявят себя сапротрофные виды грибов и бактерий, обитающие на мертвом растительном материале.