Визуализация результатов ПЦР с помощью электрофореза

В результате ПЦР получается множество копий одного или нескольких фрагментов ДНК. Для дальнейшей работы эти фрагменты надо каким-то способом зарегистрировать или сделать видимыми — визуализировать. Регистрировать ПЦР-продукт можно на протяжении всей реакции ("ПЦР в реальном времени"), либо только после ее завершения (метод "FLASH-PCR" или визуализация в геле) (см. параграф 5.4.4). В настоящем параграфе обратимся к визуализации результатов ПЦР при электрофоретическом разделении молекул ДНК по размеру.

Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 0,7—2,5% с добавлением специального интеркалирующего (т.е. способного встраиваться в молекулу ДНК между парами оснований и флуоресцирующего только после встраивания в двунитевую молекулу ДНК) красителя ДНК, например бромистого этидия (можно использовать и другие подобные красители, например "SYBR Green I"). При заливке в геле формируют лунки (с помощью специальных гребенок, помещаемых в гель перед заливкой), в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы (с повышением концентрации скорость замедляется), напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера. Молекулы ДНК одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель соединяется с молекулами ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося, как правило, от 10 мин до 1 ч, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия ультрафиолета, поглощаемая интеркалирующим красителем в области 260 нм (для бромистого этидия), передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 им для бромистого этидия). Пример электрофореграммы, показывающей идентификацию гриба Altemana altemata в пробах пораженных листьев томата с помощью ПЦР, приведен на рис. В.11.

По яркости полос на геле можно приблизительно оценить количество ДНК в ПЦР-продукте. Для этого обычно используют стандартный маркер длин фрагментов. Концентрация фрагментов определенной длины известна из инструкции к маркеру, поэтому сравнивая яркость полученных фрагментов с яркостью фрагментов маркера, можно приблизительно оценить концентрацию ПЦР-продукта.

Существует также метод оценки концентрации ДИК в исходной матрице (очень приблизительный). Для этого используют фрагмент ДНК (внутренний стандарт), который, как и фрагмент определяемой ДНК, содержит участки отжига тех же праймеров. Этот фрагмент амплифицируют одновременно с образцом определяемой ДНК. Количество ДНК внутреннего стандарта известно. При одновременной амплификации "внутренний стандарт" дает продукт иного размера, чем целевой фрагмент. "Внутренний стандарт" часто используют в диагностических системах для контроля прохождения ПЦР ("внутренний контроль").

Для разделения близких по размеру фрагментов используют метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле. Для работы с полиакриламидными гелями применяют специальные камеры для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее приготовления агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до одного или нескольких нуклеотидов возникает редко, то в рутинной работе этот метод обычно не используют.

Модификации метода ПЦР, используемые при идентификации фито- патогенов.

ПЦР с применением обратной транскрипции (ОТ-ПЦР; RT-PCR, от англ. reverse transcription polymerase chain reaction). Обычный метод ПЦР применим для анализа только ДНК-содержащих организмов. Его нельзя использовать для выявления РНК-содержащих организмов, среди которых встречаются высокопатогенные вирусы и вироиды. Используемая при классическом ПЦР Год-полимераза не способна обеспечивать синтез ДНК на РНК-матрице. При диагностике РНК-содержащих организмов используют дополнительный фермент — РНК-зависимую ДПК- полимеразу, или обратную транскриптазу (reverse transcriptase). Реакция с участием обратной транскриптазы приводит к образованию одноцепочечной кДНК, комплементарной имеющейся РНК. В дальнейшем фрагмент кДНК амплифицируется с участием ДНК-полимеразы.

У метода ОТ-ПЦР есть другое полезное применение. Как известно, мРНК (матричная РНК) может образовываться только живым организмом, в то время как ДНК может сохраняться и в мертвых. Поэтому с помощью ОТ-ПЦР можно одновременно проводить идентификацию и оценку жизнеспособности патогенов в пробе.

ОТ-ПЦР также широко используется для оценки экспрессии генов: чем активнее ген, тем больше производится мРНК, что можно оценить с помощью ОТ-ПЦР. Для оценки количества ПЦР-продукта лучше использовать Real-Time ПЦР (см. параграф 5.4.4).

ПЦР с вложенной парой праймеров (гнездовая ПЦР, Nested PCR). Характерной особенностью данного варианта ПЦР является то, что в реакции последовательно участвуют две пары праймеров, при этом вторая пара праймеров участвует в амплифицикации фрагмента ДНК внутри продукта, полученного после завершения цикла реакций с парой внешних праймеров.

Существуют две технические альтернативы проведения ПЦР с вложенной парой праймеров. Согласно первой, в реакционной пробирке после проведения 15—30 циклов амплификации получают базовый фрагмент ДНК с участием внешних праймеров. Затем переносят аликвоту содержимого в другую пробирку, в которой находится реакционная смесь с внутренними праймерами, взаимодействующими с нуклеотидными последовательностями внутри полученного фрагмента, и проводят вторую амплификацию (реамплификацию), также включающую 15—30 циклов.

Альтернативный вариант гнездовой ПЦР предполагает подбор такой температуры отжига для первой стадии, при которой вложенная пара праймеров не взаимодействует с ДНК. В этом случае температуру амплификации с внутренними праймерами поддерживают на 10—15°С ниже, чем при реакции с внешними праймерами.

Увеличение числа копий ПЦР-продукта после первой реакции позволяет существенно увеличить чувствительность и специфичность диагностики. Перенесение продукта после первого цикла реакций во вторую пробирку может способствовать снижению концентрации ингибиторов полимеразной реакции, которые иногда присутствуют в препарате. Однако, с другой стороны, в этом случае возрастает вероятность получения ложноположительных результатов из-за возможного загрязнения пробы.

ПЦР в комбинации с ELISA (Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay) (ПЦР с иммунным захватом, Immunocapture PCR). ПЦР с иммунным захватом является примером совместного использования иммунохимических (см. параграф 5.6.2) и основанных на ПЦР методов диагностики фитопатогенов.

Образец, подлежащий исследованию (например, экстракт, содержащий детектируемый вирус), добавляют в микропробирку или в лунки микропланшета, на поверхности которых сорбированы антитела, специфически связывающие искомые вирусные частицы. Это позволяет захватить из раствора нужные вирусные частицы и увеличить концентрацию ДНК- матрицы. На следующей стадии из этих частиц освобождают вирусную ДНК или РНК и проводят, соответственно, НЦР или ОТ-ПЦР.

Обычно ПЦР с иммунным захватом усиливает специфичность и чувствительность диагностики фитопатогенов. Он также полезен в случае, если в образце присутствуют компоненты, ингибирующие полимеразную реакцию, поскольку снижает или устраняет их влияние.

Метод БИО-ГЩР (BIO-PCR) совмещает в себе культивирование микроорганизмов из пораженной пробы па селективной среде и последующее проведение ПЦР с целью идентификации определенных патогенов, накопившихся во время инкубации. Этот метод, широко применяемый для обнаружения фитопатогенных бактерий, может быть использован и для грибов.

При проведении анализа с помощью БИО-ПЦР исследуемый образец помещают на агаризованную или в жидкую селективную среду и инкубируют при оптимальных для выявляемого патогена условиях внешней среды. После инкубации определяемые бактерии накопятся в количестве, достаточном для диагностики. Затем их смывают с поверхности агара или осаждают из жидкой среды центрифугированием и отбирают от 1 до 10 мкл образца для ПЦР.

Этот метод отличается высокой чувствительностью и особенно подходит для быстро растущих видов. Метод БИО-ПЦР позволяет выявлять даже единичные экземпляры искомого фитопатогена в пробе.