Системы детекции ПЦР-продукта

Системы детекции можно разделить на специфичные и неспецифичные к определенной последовательности ДНК. Специфичные системы позволяют достоверно регистрировать накопление фрагментов ДНК определенной последовательности.

Неспецифичные системы детекции можно разделить на системы с использованием интеркалирующих красителей и системы с мечением праймеров флуоресцентными красителями.

1. Использование интеркалирующих красителей — наиболее простой и дешевый вариант окраски ДНК для целей Real-Time PCR. Неспецифичные системы детекции выявляют любую двуцепочечную ДНК, образовавшуюся в ходе реакции. Интеркалирующие красители — это соединения, приобретающие возможность флуоресцировать при встраивании в двуцепочечную ДНК (их способность к флуоресценции после встраивания возрастает в сотни раз). В настоящее время существует множество коммерчески доступных интеркалирующих красителей: бромистый этидий, "YOYO", "YO-PRO-І", "SYBR Green I", "SYBR Gold" и др. Самый распространенный из них — бромистый этидий, применяемый при электрофорезе. Однако он негативно влияет на ПЦР, в связи с чем его не применяют в Real-Time PCR. Наиболее распространен в Real-Time PCR краситель "SYBR Green І" (рис. В.12) ^[1].

Хотя использование интеркалирующих красителей удобно и недорого, оно имеет существенный недостаток: выявляются любые двунитевые фрагменты, включая димеры праймеров. Появление флуоресцентного сигнала в ходе реакции не позволяет исследователю быть уверенным, что в результате реакции наработай целевой фрагмент.

2. Системы с мечением праймеров флуоресцентными красителями и гасителями ("амплифлюр"). В наиболее используемом варианте исполнения праймер несет дополнительную последовательность на 5' конце, способную образовывать шпилечную структуру — инвертированный концевой повтор (ИКП). Флуоресцентная метка (флуорофор) и гаситель люминесценции расположены так, что при образовании шпилечной структуры флуорофор и гаситель оказываются сближены. В растворе праймеры сохраняют структуру шпильки, имеющую низкий уровень флуоресценции. В ходе реакции шпилька меченого праймера раскрывается, поскольку меченый праймер становится частью ампликона. Удаление флуорофора от гасителя приводит к усилению люминесцентного сигнала. Система не является специфичной, так как флуоресцировать может не только целевой продукт, но и димеры праймеров.

Систему с использованием меченых праймеров можно сделать специфичной, добавив дополнительную флуоресцентно-меченую гибридизационную пробу (см. ниже о разрушаемых пробах TaqMan). Для этого пробу метят флуорофором, отличным от флуорофоров праймеров. При таком подходе специфичная амплификация приведет к возрастанию сигнала и от праймера, и от пробы. Наличие сигнала только от праймера в этом случае говорит о неспецифичном продукте реакции (например, образовании димеров праймеров).

Специфичные системы детекции позволяют достоверно регистрировать накопление фрагмента ДНК строго определенной последовательности. Все специфичные системы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием в реакционной смеси меченого флуорофором олигонуклеотида, неспособного выступать в качестве затравки. Меченый нуклеотид может быть прикреплен к праймеру или находиться в растворе в свободной форме (проба или зонд). Рассмотрим метод работы разных типов меченых проб: линейных разрушаемых проб, "молекулярных маячков", праймеров-проб.

1. Линейные разрушаемые пробы (TaqMan). Олигонуклеотид, комплементарный участку нужного ПЦР-продукта, метят флуорофором и гасителем люминесценции. В отсутствии ампликона — мишени — флуорофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего продукта реакции проба гибридизуется на ампликон, после чего разрушается за счет 5'-концевой активности Taq-полимеразы (рис. В.13) ^[2].

5'-концевая активность позволяет полимеразе удалять с цепи матрицы все находящиеся на ней "мусорные" фрагменты — как отдельные нуклеотиды, так и олигонуклеотиды. Разрушение пробы приводит к отрыву флуорофора от гасителя и началу люминесценции. Интенсивность люминесцентного сигнала возрастает с каждым циклом ПЦР пропорционально накоплению целевого ПЦР-продукта. Пробу можно использовать совместно с мечеными праймерами (праймеры метятся флуорофором с другой длиной волны излучения, см. выше). При использовании TaqMan необходимо использовать полимеразу с хорошо выраженной 5'-экзонуклеазной активностью (например, Taq- или Tth-полимеразы).

2. Пробы с инвертированными концевыми повторами ("молекулярные маячки", beacons). На концах олигонуклеотида-зонда располагается короткий (5—8 пн) инвертированный повтор. Флуорофор и гаситель располагаются по концам олигонуклеотида. В растворе при температуре 55—60°С и ниже образуется петля, склеенная по инвертированным повторам. В результате флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости друг от друга, и гаситель поглощает энергию флуорофора.

При гибридизации с ампликоном проба разворачивается, гаситель удаляется от флуорофора, уровень флуоресценции сильно повышается (рис. В.14) ^[3]. Однако данный способ работает только с полимеразами без 5'-"экзонуклеаз- ной активности. При использовании полимеразы с 5' - экзонуклсаз ной активностью (например, Taq- или Tth-полимеразы) гибридизованная с ампликоном проба будет разрушаться точно так же, как в зонде TaqMan. Однако на качестве детекции накопления целевого ампликона это не отразится.

3. Праймеры-пробы (скорпионы, scorpions). В данном методе детекции праймеры и пробы объединили в одну молекулу. Для этого к 5'-концу праймера прикрепили структуру типа И КП, причем истлевая часть комплементарна внутренней части образующегося фрагмента. Флуоресцентно меченая 5'-концевая часть (проба) отделена от З'-концевой части (праймер) блокатором, препятствующим синтезу второй цепи ДНК. После образования ПЦР-продукта петлевая часть пробы может гибридизоваться на внутреннюю часть фрагмента, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя, вследствие чего возрастает уровень флуоресценции. Однако при использовании полимеразы с 5'-экзонуклеазной активностью гибридизованная часть (проба) будет разрушаться ферментом (рис. В.15) ^[4]. Следовательно, в общей интенсивности флуоресцентного сигнала будет как составляющая "разворачивания", так и составляющая разрушения адаптера.

При рассмотрении методов Real-Time PCR нельзя обойти вниманием метод ПЦР с детекцией по "конечной точке" (Fluorescent Amplification- based Specific Hybridization, FLASH), применяемый во многих лабораториях. Этот метод можно считать бюджетным вариантом Real-Time PCR, так как для его проведения достаточно обычного ПЦР-аппарата и нет необходимости в дорогостоящем детектирующем амплификаторе. В отличие от настоящего Real-Time PCR, при котором измерения флуоресценции проводят на каждом цикле реакции, метод FLASH предполагает только одно измерение после завершения реакции с помощью специального детектора (рис. В. 16). Достоинствами метода FLASH-PCR являются как возможность быстрой детекции результатов ПЦР, не открывая пробирки, так и возможность использования тест-систем, разработанных для Real-Time PCR. При работе с технологией FLASH можно использовать как неспецифические интеркалирующие красители, например "SYBR Green I", так и тест-системы для Real-Time PCR. При анализе методом FLASH-PCR хорошие результаты дает использование проб типа "Молекулярный маячок", поскольку у них низкий уровень фоновой флуоресценции.

Благодаря малому весу, компактности и низкому энергопотреблению FLASH-PCR широко применяется в организации мобильных лабораторий (см. рис. В.8) ^[5]. Отсутствие необходимости электрофореза и непосредственного контакта с ПЦР-продуктом исключает загрязнение ПЦР-лаборатории ампликонами.