Определение чувствительности по методу серийных разведений

Компоненты, мл	Пробирки
								контроль бактерий	контроль антибиотика
МПБ	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0
Пенницилин, 100 ОД/мл	2,0	→	→	→	→	→	→	↑	-	2,0
Концитрация антибиотика, ОД/мл			12,5	6,3	3,2	1,6	0,8	0,4	-
Суспензия бактерий, 10⁵ /мл	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	-
Инкубация в термостате при 37⁰ С 18-24 ч
Результат

Среду предварительно разливают в пробирки по 2 мл. В первую добавляют 2 мл раствора антибиотика определенной концентрации, перемешивают и переносят к следующей пробирке, продолжая разведение к предпоследней, из которой удаляют 2 мл смеси. Последняя пробирка служит контролем роста культуры. В том жебульйони, который используют для разведения антибиотиков, готовят суспензию суточной агаровой или бульйоннои культуры бактерий из расчета 105-106 микробных тел в 1 мл в зависимости от вида возбудителя. Потом к каждой пробирке с разведениями, а также к контрольной добавляют по 0,2 мл изготовленной суспензии. При определении чувствительности к пеницилинив пеницилиназоутворюючих стафилококков рекомендуют использовать одновременно большую и малую микробную нагрузку (100, 100000 и выше микробных тел в 1 мл). В зависимости от величины посевной дозы значения МПК препарата может колебаться: при увеличении дозы чувствительность снижается за счет роста количества пеницилинази, что образуется в среде.

Пробирки инкубируют в термостате при 37 °С в течение 18-24 год. Результаты учитывают, определяя наличие или отсутствие роста в среде с разными разведениями препарата.

Последняя пробирка, в которой наблюдают задержку роста культуры (прозрачный бульйон), отвечает МПК (минимальной подавляющей концентрации) илиМБсК (минимальной бактериостатической концентрации) препарата относительно данного микроба и указывает на степень его чувствительности.

Если признаки роста появляются во всех пробирках, исследуемый штамм резистентный к максимальной концентрации препарата, которая была взята в опыт. Отсутствие роста бактерий во всех пробирках, кроме контрольной, свидетельствует, что МПК препарата ниже, чем и, что используется в опыте.

Для определения бактерицидного эффекта антибиотика из нескольких последних пробирок, в которых нет признаков роста, делают висел на секторы агара в чашках Петри.

Через 24-48 год инкубации при оптимальной температуре отмечают ту наименьшую концентрацию препарата в пробирке, занял из которой

VIDEO

Принцип метода серийных разведений в плотной питательной среде аналогичен предыдущему. Для этого готовят серию разведений антибиотика в агаре, добавляя один объем, который содержит определенное количество препарата до 9 объемов агара. Для этого удобно разлить агар во флаконы или широкие пробирки по 13,5 мл. Перед постановкой агар расплавляют на водяной бане и после охлаждения до 60-65 °С в каждую пробирку добавляют 1,5 мл соответствующего разведения антибиотика (в бульйоне), тщательным образом перемешивают и выливают в чашку Петри. В контрольную пробирку с агаром вместо раствора антибиотика вносят 1,5 мл дистиллированной воды. Чашку разделяют на секторы, на каждый из которых засевают исследуемый штамм. Посевы делают бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Для посева удобно использовать специальный штамп-репликатор, который позволяет нанести одновременно на поверхность агара 25-50 исследуемых культур. Результаты учитывают после 18-24 год инкубации в термостате при оптимальной температуре.

За МПК (минимальную подавляющую концентрацию) антибиотика для данного штамма принимают ту, при которой отсутствуют признаки роста колоний на поверхности агара (или вместо бляшки есть рост одиночных колоний).

Из двух способов определения антибиотикочутливости микробов до антибиотиков (разведений в густой и жидкой средах) точнее является метод серийных разведений в жидкой среде. Результаты, которые получают с помощью разведений в агаре, менее постоянны. Метод не следует применять при оценке чувствительности тех микробов, которые дают тонкий, разрежен рост на поверхности чашки (стрептококки, пневмококки) или, напротив, имеют тенденцию к ползучему росту (протей).

Недостатком методов серийных разведений является их высокая трудоємнисть, что ограничивает использование в обычных бактериологических лабораториях. С целью упрощение было предложено модификацию метода с заменой ряда из 10 пробирок, которые содержат разные количества препарата, тремя концентрациями антибиотика. Первая из них отвечает максимальной, что находится в крови при введении терапевтических доз, вторая – уровню, который наблюдается через Т1/2 (время снижения концентрации антибиотика на 50 %). Третья является минимальной, то есть той, которая равняется МПК для высокочувствительных штаммов. В соответствии с использованными концентрациями антибиотиков исследуемые штаммы можно отнести за уровнем чувствительности до трех основных групп: резистентные (МПК для которых превышает значение максимальной концентрации антибиотика в крови), умеренно чувствительные (значения МПК приближаются к максимальной или средней концентрации) и высокочувствительные (чувствительность которых к антибиотику находится на уровне минимальной концентрации, которая используется в опыте). Такими концентрациями при определении чувствительности к бензилпеницилину является соответственно 0,05-0,2, 0,5 и 2,0 ОД/МЛ, к макролидам – 0,1, 0,5-1,0 и 4,0 мкг/мл, к аминогликозидив – 0,5-1,0, 6,0-8,0 и 15,0-20,0 мкг/мл.

Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Используя обычные методы, ответ может быть получен через 18-20год от начала исследования, не учитывая этапов выделения чистой культуры. Это приводит к тому, что в большинстве случаев особенно при затяжном и тяжелом течении болезни, лечение антибиотиками начинают задолго до получения данных лабораторного обследования. В зависимости от принципов, на которых они базируются, ускоренные методы предусматривают:

• определение изменений ферментативнои активности микроорганизмов под воздействием антибиотиков;

• определение цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно восстановительного потенциала во время роста бактерий в питательной среде;

• цитологичну оценку изменений морфологии бактериальных клеток под воздействием антибиотиков.

К первой группе принадлежит метод Роджерса, ориентированный на способность антибиотиков подавлять ферментативну активность чувствительных микроорганизмов, которая сопровождается изменением цвета соответствующего индикатора. Суть его заключается в дифференцированном изменении красного цвета фенолового красного на желтый или фиолетовый в зависимости от чувствительности исследуемого штамма. В случае чувствительности к действию антибиотика не происходит разложение глюкозы при культивировании в среде, которое содержит ее и определены концентрации препарата. При этом среда окрашивается в фиолетовый цвет в результате сдвига рН в щелочную сторону. Изменение красного цвета на желтый свидетельствует о расщеплении глюкозы с образованием кислоты в результате роста штамма, резистентного к действию антибиотика. Если к среде прибавить 0,25 % дрожжевого экстракта, результаты могут быть учтенными уже через 2-2,5 год от начала исследования.

Далее группа методов регистрирует изменения окислительно восстановительного потенциала среды в процессе роста микроорганизмов, о чем свидетельствует изменение цвета резазурина, 1,3,5-трифенилтетразолия хлорида, 2,6-дихлорфенолиндофенола и других, которые добавляются к среде. Этот метод технически простой, а результаты получают через 2-6 год. Принцип его сводится к тому, который растоплен и охлажден до 50 °С агар засевают исследуемой культурой бактерий из расчета 200 млн. микробных тел, а на поверхность налагают диски с антибиотиками. Чашки инкубируют при оптимальной температуре в течение 3-5 год, потом обрабатывают индикатором и повторно инкубируют при 37 °С в течение 20-30 хв. Результаты учитывают за изменением цвета вокруг дисков с антибиотиками. Если используют 1 % раствор 1,3,5-трифенилтетразолия хлорида, участка агара с бактериальным ростом в результате образования формазануприобретают красный цвет, а зоны притеснения роста вокруг дисков остаются бесцветными.

Судить о степени чувствительности микробов к антибиотикам можно с такой же точностью, как и с помощью стандартного метода дисков, однако время исследования уменьшается до 3-5 год.

Образование инволюционных форм бактерий под воздействием антибиотиков исследуют под фазово-контрастным или антоптральним микроскопом в специальных микрокапсулах. Они образуются в результате действия бактериостатичних концентраций препарата. Под воздействием суббактериостатичнихконцентраций, а также при резистентности исследуемого штамма на поверхности агара вырастают нормальные микроколонии.

Метод может быть применен для определения чувствительности штаммов кишечной палочки, стафилококков, холерных вибрионов. Полученные даны в большинстве случаев совпадают с теми, которые дают классические методы.

За последние годы разработаны многочисленные модификации метода серийных разведений в питательных бульйонах. В частности, экспресс-методы с титрованием антибиотика в объеме 0,25 мл.

Выпускаются коммерческие наборы длительного хранения, которые состоят из планшетов из лиофильно высушенными разведениями антибиотика, куда вносится по 0,1 мл суспензии чистой культуры микроорганизмов. Результаты определения антибиотикочутливости можно оценивать визуально (при наличии в среде индикатора) или с помощью спектрофотометров, когда регистрируется изменение оптической плотности среды.

Определять чувствительность бактерий к антибиотикам можно и с помощью автоматизированных микробиологических систем (“Autobac MS-2”, “Cobas Micro”,Quantum 2, Sceptor и др.). При их использовании результаты получают уже через 3-10 год. Одно из их преимуществ заключается в том, что они позволяют получать результаты одновременно до 18-20 антибиотиков. Эти методы широко используют в микробиологических лабораториях, они хорошо коррелируют с другими методиками и за их помощью можно не только выбирать рациональную схему антибиотикотерапии, но и проводить эпидемиологический контроль резистентности.

Однако при пользовании такими автоматизированными системами частота выявления резистентных штаммов может быть снижена в результате медленного роста устойчивых вариантов. В большинстве подобных систем результаты учитывают путем сравнения роста (или гибели) бактериальных клеток в присутствии антибиотиков с контролем, где есть только микробы. При этих условиях достаточно трудно дифференцировать клетки, которые погибают, от тех, что медленно размножаются.

К другим факторам, которые влияют на результаты, принадлежит действие субингибиторних концентраций препаратов на ультраструктуру бактериальных клеток. Они приводят к изменению формы, набухания клеток, которое может сопровождаться изменением оптической плотности суспензии и искажением результатов. В свою очередь, это дает неправильную информацию о чувствительности возбудителей.

Таким образом, применение любого метода позволяет определить антибиотикограму возбудителя – спектр его чувствительности и антибиотикостийкости.

Все методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам имеют свои преимущества и свои недостатки. Потому постоянный контроль за объективностью результатов и соблюдением правил проведения исследований способствуют получению достоверных данных.

В большинстве случаев результаты определения антибиотикоустойчивости in vitro совпадают с клиническими последствиями антибиотикотерапии. Случаи разногласия объясняются рядом причин, среди которых чаще всего встречается ошибочная трактовка полученных лабораторных данных.

Причиной таких ситуаций может быть использование при посеве не чистой культуры бактерий, а патологического материала. Потому определяется не чувствительность инфекционного агента, а микробной ассоциации, в том числе и сапрофитной флоры. Ошибки встречаются при исследовании содержания двенадцатиперстной кишки, фекалиий, харкотиння, выделений из ран, мочи и тому подобное.

Плазмиды делают бактерии нечувствительными к подавляющему большинству антибиотиков, которые используются в клиниках, поскольку кодируют синтез ферментов, которые разрушают препараты. Одним из наиболее исследованных ферментов является бета-лактамаза, которая разрушает антибиотики, которые принадлежат к группе бета-лактамив. Разработано несколько методических приемов, которые позволяют быстро определить ее активность. Один из них заключается в том, что на фильтровальную бумагу размером 2х2 см, который находится в чашке Петри, капают одну каплю 2 % водного раствора крахмала. Потом на эту бумагу наносят петлей агаровую культуру микробов и растирают ее, формируя бляшку диаметром до 5 мм. На ее поверхность наносят рабочий йодный растворпенициллина.

Учет результатов проводят через 10 минут инкубации системы при комнатной температуре. При наличии бета-лактамазы на темно-синем фоне наблюдается ярко выраженная четкая зона просветления вокруг бляшки, которая содержит агаровую культуру микробов. При негативном результате зона просветления отсутствует, а края бляшки нечетки.

Определение концентрации антибиотиков в биологических жидкостях. При тяжелых инфекционных процессах, например, сепсисе иногда придется определять концентрацию антибиотиков в биологических жидкостях, в частности, сыворотке крови, мочи. Для этого используют метод серийных разведений в жидкой среде с глюкозой и индикатором Андреде. В двух параллельных рядах готовят серийные разведения сыворотки и стандарта антибиотика. Потом к каждой пробирке, включая контрольные, добавляют стандартную суспензию тестовых микробов. Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 18год. В тех пробирках, где концентрация антибиотика подавляет микробов, среда остается бесцветной и прозрачной. Если микроорганизмы прорастают, об этом свидетельствует помутнение среды и появление розовой расцветки.

Можно использовать также фенол-сироваткове среду с индикатором феноловым красным. В этом случае при отсутствии роста микроорганизмов среда остается красной, а при наличии признаков роста становится мутным и приобретает желтый цвет.

Исходя из данных таблицы, раствор стандарта пенициллина задерживает рост тестовых микробов в концентрации 0,025 ЕД/МЛ, а исследуемая сыворотка – в разведении 1:8. Следовательно, содержание пеницилина в сыворотке крови будет равняться 0,2 ОД/МЛ (0,025 ЕД/мл).

Определение концентрации пенициллина в сыворотке крови

Пробирки
Разведение сыворотки	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32
Рост тест-микробов	-	-	-	+	+
Концентрация стандарта пенициллину в среде ОД/мл	0,2	0,1	0,05	0,025	0,0125
Рост тест-микробов	-	-	-	-	+