Связывание с тетрамерными структурами MHC класса I
Конструирование тетрамерных комплексов MHC класса I обеспечило создание быстрого, специфичного и высокочувствительного метода выявления и подсчета антигенспецифических CD8+ Т-клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. Тетрамер состоит из молекул MHC класса I, нагруженных специфическим антигенным пептидом, связанных с биотином, которые затем прикрепляются к стрептавидину, меченному флуорохромом - ФИТЦ, ФЭ и др. (рис. 3.1, см. также цв. вклейку). Тетрамеры MHC класса I связываются с CD8+ субпопуляцией Т-лимфоцитов. Созданы тетрамеры MHC класса II, связывающиеся с CD4+ Т-лимфоцитами. Тетрамерные структуры характеризуются сниженной способностью связывания с молекулой CD8. Однако сохраняют способность специфически связываться с TКР, обеспечивая точное узнавание антигенспецифических Т-клеток. Количество выявляемых данным методом антигенспецифических клеток составляет менее 1% от всех CD8+-клеток.
Отдельное использование тетрамерного связывания не дает информации о фенотипе клеток или функции ЦТЛ, поэтому целесообразно параллельно проводить определение внутриклеточного содержания цитокинов, хемокинов и цитотоксических эффекторных молекул (перфорина, гранзимов), фенотипа специфических CD8+ Т-лимфоцитов.
Рис. 3.1.Тетрамерные структуры: а - строение тетрамерной структуры; б - связывание тетрамера ЦТЛ; в - пример результатов, полученных при анализе тетрамерных структур на проточном цитофлуориметре; ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоционат; ФЭ - фикоэритрин
Использование методов цитофлуориметрического определения цитотоксической активности в комбинации с тетрамерным методом и иммунофенотипированием позволяет полно охарактеризовать популяции КЭ (ЦТЛ) и КМ. Данные методы - мощный инструмент для изучения кинетики киллерной активности ЦТЛ, они дают представление о фенотипе клеток и позволяют отслеживать физиологические изменения в КЭ и КМ