Чувствительность иммуноанализов
Термин «чувствительность» применительно к иммуноанализам имеет два разных смысла.
1. Чувствительность в физико-химическом понимании - это определяемая данным анализом минимальная концентрация искомого вещества в пробе. Как правило, для большинства ИФА-тест-систем такая чувствительность составляет нанограммы в миллилитре.
2. Второе понимание термина «чувствительность» - популяционное и относится к диагностическим тест-системам, предназначенным для выявления тех или иных маркеров заболеваний, чаще всего инфекционных.
При разработке любой тест-системы пользуются биологическим материалом, скажем, пробами крови людей, заведомо больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно позитивными), и людей, заведомо не больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно отрицательными).
Параметры рассчитывают по приведенным ниже формулам, где N - число тех или иных результатов конкретных анализов на биологическом материале от пациентов с достоверно известными диагнозами.
Чувствительность иммуноанализа в данном случае - это параметр, всегда привязанный к конкретной тест-системе, а не только к принципу метода. Чувствительность зависит от аффинности и авидности взаимодействия используемых (или искомых) антител с искомым (или используемым) антигеном, от других реагентов, включенных в систему, от времени и температуры инкубаций.
Поскольку связывание антител с антигенами не подчиняется линейным зависимостям, то в целях попадания в «зоны эквивалентности» практически во всех вариантах иммуноанализов принято так называемое титрование сывороток или растворов антигенов, т.е. сыворотки (или растворы антигенов) разводят известным образом (двукратные, пятикратные, десятикратные или иные разведения) и каждое из разведений пускают в иммуноанализ. Для того чтобы установить нижнюю границу достоверных признаков связывания антител с антигеном (cut-off - граница отличия отрицательных результатов от положительных), в каждой постановке иммуноанализов обязательно применение заведомо отрицательных и заведомо положительных контрольных сывороток. Если целью анализа является определение не титров сывороток, а численных концентраций искомых антител или антигенов, то прибегают к калибровке. Для этого тест-система должна располагать калибровочными растворами (от 3 до 10 точек), содержащими известные нарастающие концентрации искомого вещества, а система регистрации результатов тоже должна быть «оцифрована», например в единицах оптической плотности, измеряемых спектрофотометрически, или в единицах флюоресцентного излучения, измеряемого флюориметрами, или в единицах числа импульсов в минуту, измеряемых счетчиками радиоактивности (в случае радиоиммуноанализов). В диапазонах прямолинейности калибровочной кривой возможно определение искомых концентраций в испытуемых биопробах.
Учитывая сказанное, мы приведем лишь порядок концентраций, выявляемых с помощью различных технологий иммуноанализов. При этом конкретные тест-системы в пределах одной технологии могут по чувствительности отличаться друг от друга также на порядки.
Методы преципитации, агглютинации и иммунодиффузии работоспособны при концентрациях искомых веществ порядка миллиграммов на миллилитр. Как правило, калибровочные растворы имеют диапазон концентраций от 1 до 0,1 мг/мл.
Твердофазные радиоиммуноанализы и иммуноферментные анализы работают в большинстве тест-систем в нанограммовых диапазонах концентраций (нанограммы на миллилитр). Однако ловушечные конструкции тест-систем, а также иммунометрические тест-системы могут иметь существенно более высокую чувствительность, например 10-12-15 г/мл.