Bordetella pertussis
1. Изучение мазка из чистой культуры B.pertussis, окрашенного по Граму(зарисовать)
В мазке, окрашенном по Граму, видны мелкие овоидные коккобактерии грамотрицательные, располагаются одиночно, парами, иногда короткими цепочками, более интенсивно окрашены по полюсам (зарисовать).
2. Изучение лабораторного диагноза коклюша и паракоклюша по схеме(зарисовать в тетрадь)
Род Bordetella имеет семь видов, которые необходимо дифференцировать при бактериологическом исследовании.
Вид B.pertussis представлен мелкими грамотрицательными палочками, или овоидами, не растет на МПА. Рост на МПА ингибируется ненасыщенными жирными кислотами, образующимися в процессе метаболизма. Для его культивирования используют среду Борде-Жангу, казеиново-угольный агар (КУА). На этих средах через 72 часа при 37° вырастают мелкие гладкие выпуклые с металлическим блеском колонии. Углеводы не ферментирует, мочевину не разлагает. Содержит 1 фракцию агглютиногена. Характеризуется выраженной изменчивостью культуральных свойств.
Различают 4 фазы, которым характерны определенные морфологические и биологические свойства. Первая фаза соответствует S-форме коклюшных бактерий. Свежевыделенные культуры, как правило, находятся в первой фазе. Вторая и третья фазы являются переходными, микроб характеризуется полиморфизмом: во второй фазе еще отмечаются палочки разных размеров, а в третьей фазе – коккобактерии скоплениями в виде групп. Колонии микробов второй и третьей фаз гораздо крупнее (1–1,5 мм), плоские, слизистые, склонны к слиянию. В четвертой фазе бактерии коклюша имеют форму грамотрицательных палочек или кокковидных образований с выраженной окраской одного из полюсов, колонии вырастают до 3 мм уплотненные слизистые.
Вид B.parapertussis является возбудителем паракоклюша. По морфологии сходен с возбудителем коклюша. Неподвижен. К условиям культивирования не требователен, растет на МПА, образуя колонии через 24–48 часов. Бордетеллы паракоклюша способны расщеплять тирозин, поэтому на средах, содержащих эту аминокислоту, наблюдается коричневое окрашивание. Углеводы не ферментируют, но расщепляют мочевину. Содержат ряд агглютиногенов, специфичным для них является 14-ый агглютиноген.
Вид B.bronchiseptica – обитатель дыхательных путей человека и животных, но, в отдельных случаях, у ослабленных людей может вызвать поражение дыхательных путей. По морфологии идентичен другим бордетеллам. Подвижен. К питательным средам неприхотлив, растет на МПА, цвета среды не изменяет. Углеводы не ферментирует, расщепляет мочевину, редуцирует нитраты, оксидазоположителен. Содержит агглютиногены, специфическим для данного рода является 12-й агглютиноген.
Возбудители коклюша и паракоклюша вызывают заболевание, близкое по клинической картине, эпидемиологии, поэтому лабораторное исследование ведут одновременно на выделение обоих микробов.
Патологический процесс локализуется в носоглотке и может распространяться до альвеол. Материалом для исследования служит отделяемое слизистой оболочки носоглотки. Материал может быть собран несколькими методами:
Взятие материала тампоном. Материал забирают медицинские сестры. Для этого используют два тампона: один сухой, другой смачивают средой КУА. Перед взятием материала тампон изгибают под углом 120 градусов. Ребенок открывает рот, стерильным шпателем надавливают на корень языка и вводят тампон, пока он не прикоснется к задней стенке глотки. При этом возникает кашель, который сопровождается отделением слизи. Тампон вынимают и делают посев на поверхность среды.
Более щадящим является взятие материала через нос. Для этого тампон на гибкой проволоке проводят через ноздрю до носоглотки, берут материал и производят посев.
При взятии материала необходимо выполнить ряд требований. Сбор материала производят натощак или через 2–3 часа после еды. При взятии материала тампон не должен касаться слизистой языка и щек.
Метод кашлевых пластинок.
Открытую чашку Петри с КУА (или другой питательной средой) в момент кашля подносят ко рту и держат на расстоянии 8–10 см несколько секунд, чтобы уловить 5–6 кашлевых толчков. Чашку быстро закрывают и помещают в термостат.
Если сбор материала производят вне лаборатории, то нужно оберегать чашки при транспортировке от охлаждения. Для этого чашки и пробирки заворачивают в плотную бумагу, потом в вату, а в случае холодной погоды в сумку или ящик сначала кладут грелку с горячей водой, а затем укладывают чашки и пробирки.
Методы микробиологической диагностики:
- бактериологический
- серологический
Основным методом лабораторной диагностики является бактериологическое исследование. Выделение возбудителя находится в прямой зависимости от сроков забора материала. Так, наибольшее количество положительных результатов (до 95%) получают в первые 2 недели заболевания, что совпадает с высокой заразительностью больного, к 4-й неделе болезни высеваемость возбудителя падает до 50%, а на 5-й высеять возбудителя не удается.
Бактериологический метод. Бактериологический метод основан на выделении возбудителя из носоглоточного отделяемого.
1-й день исследования. Материал, взятый тампоном, засевают на чашки с казеиново-угольным агаром, в который предварительно добавляют пенициллин для подавления сопутствующей флоры носа и рта. Тампоном засевают 2 чашки, сначала материал втирают на ограниченном участке среды (площадке сброса), а потом штрихами на несколько секторов, поворачивая тампон всеми сторонами и тщательно втирая материал в поверхность среды. Посевы помещают в термостат при 37 градусах на 5 дней.
Начиная со второго дня, просматривают посевы.
3-й день исследования. Колонии паракоклюшных палочек появляются через 24–48 часов, колонии коклюшных бактерий – через 48–72 часа. Выросшие колонии просматривают, пользуясь лупой или стереоскопическим микроскопом.
Коклюшные и паракоклюшные бактерии на КУА растут в виде мелких блестящих выпуклых влажных серых колоний. Колонии у паракоклюшных палочек несколько крупнее. Колонии коклюшных палочек похожи на капельки ртути. При изучении в стереоскопическом микроскопе видна тень, которую отбрасывают колонии палочек коклюша – световой конус, Если менять положение источника света, то и тень изменит свое положение. Наличие светового конуса имеет диагностическое значение.
При наличии подозрительных колоний первой фазы их выделяют на чашки с КУА, разделенным на сектора или в пробирки. Посевы помещают в термостат. Если колоний много, то из части их делают мазок, окрашивают его по Граму и смотрят под микроскопом. При обнаружении мелких грамотрицательных палочек ставят реакцию агглютинации на стекле с родовой моноспецифической сывороткой, содержащей антитело 7. Положительная реакция агглютинации наступает быстро и свидетельствует о принадлежности выделенной культуры к роду Bordetella. Для определения вида бордетелл ставят реакцию агглютинации с видовыми моноспецифическими сыворотками 1 и 14. При положительной реакции выдают предварительный ответ.
4-й день исследования. Выросшие чистые культуры изучают, обращают внимание на цвет среды КУА. Затем делают мазки, окрашивают по Граму, изучают под микроскопом. Повторно из чистой культуры ставят реакцию агглютинации на стекле с видовыми моноспецифическими сыворотками 1,2,3 и 14, чтобы отдифференцировать виды бордетелл и определить варианты (при проведении эпидемиологического анализа).
Так как коклюшные и паракоклюшные палочки имеют общие антигены, для окончательной идентификации и дифференциации их ставят пробу на наличие уреазы, изучают способность роста на простом агаре и агаре с тирозином, изменение цвета КУА и кровяного агара (табл.20).
5-й день исследования. Учитывают полученные данные и по их совокупности выдают ответ о выделении возбудителей коклюша или паракоклюша.
Таблица 20