Історія розвитку люмінесцентного аналізу.
Люмінесцентний якісний і кількісний аналіз в медико-біологічних дослідженнях
П л а н :
1. Загальні дані про люмінесценцію.
2. Історія розвитку люмінесцентного аналізу.
3. Апаратура.
4. Фотолюмінофори.
5. Визначення інтенсивності люмінесценції.
Загальні дані про люмінесценцію.
Люмінесценція - особливий вид світіння речовин без підвищення температури - відома ще з глибокої старовини. Однак пройшло багато століть, перш ніж людині вдалось цілком розкрити її природу.
Наукову розробку цього питання починають В. В. Петров, Стоці, Беккерель.
Термін "люмінесценція" і класифікацію типів світіння вперше запропонував німецький фізик Видеманн. Однак його визначення було неповним.
При люмінесцентному аналізі в хірургії в основному приходиться мати справа з фотолюмінісценцією, одержуваної під дією ультрафіолетових променів.
При фотолюмінісценції частка починає інтенсивно світитися в результаті захоплення квантів активуючого світла. Причому, повертаючись до вихідного стану, він віддає отриману енергію у виді світла, довжина хвилі якого більша довжини хвилі джерела порушення.
Тарьян вважав, що порушення, чи іонізація електронів, завжди є первинним процесом виникнення люмінесценції. Розрізняють два типи люмінесценції - флуоресценцію і фосфоресценцію.
Флуоресценція - це світіння, що спостерігається під час активації, а фосфоресценція - світіння, що продовжується деякий час після припинення активації. В медицині надають більшу перевагу флуоресценції.
В.А. Юсін виділяє три види люмінесценції: вільну, або первинну, масковану та вторинну, або експериментальну.
Вільна, люмінесценція відзначається в тому випадку, коли в досліджуваному матеріалі вже маються активні флуорохроми. Маскована люмінесценція спостерігається тоді, коли під впливом хімічних процесів раніше неактивні флуорохроми переходять в активні. Вторинна, чи експериментальна, люмінесценція має місце, коли в організм або у досліджуваний матеріал попередньо вводять флуорохроми (офарбовують його).
Історія розвитку люмінесцентного аналізу.
Історія люмінесцентного аналізу пов'язана з розвитком навчання про люмінесценцію взагалі.
Початок розвитку цього методу відноситься до глибокої старовини. Віками люди спостерігали за світінням у темряві гнилого дерева, комах, однак природа цього явища тривалий час залишалася нерозкритої. Рукописні зведення про люмінесценцію починаються з Каскаріоло, що у 1604 р. синтезував першу штучну речовину здатну до люмінесценції (болонский фосфор).
Пізніше алхіміки відкрили цілий ряд мінералів, що світяться в темряві. Досвід обмежувався якісними спостереженнями і складанням хімічних рецептів фосфорів.
Перший крок у дослідженні люмінесценції зробив російський академік В.В. Петров. Він вивчав біологічну тканину (гниюче м'ясо, рибу та ін.) і підійшов до проблеми світіння винятково з хімічної точки зору. На підставі цих дослідів В.В. Петрову вдалося відокремити хемілюмінесценцію від фотолюмінісценції.
Гершель у 1800 р. відкрив інфрачервоні промені. Це навело на думку про те, що до фіолетової частини спектра примикає область невидимих променів, що незабаром були виділені і названі ультрафіолетовими. В.В.Петров у 1802 р. винайшов дугову лампу, що являлася могутнім джерелом ультрафіолетових променів. Наприкінці XІХ ст. з'являються перші дисертаційні роботи з застосування люмінесцентного аналізу, що стосуються вивчення біологічних об'єктів.
У 1903 р. Вуд запропонував виділяти потрібний для люмінесценції спектр променів, використовуючи для цього спеціальний фільтр. Користуючись цим фільтром, автор вивчав флуоресценцію шкіри, волосся, зубів. У 1918 р. він описав флуоресценцію кришталика ока людини.
Справжнім поштовхом до практичного застосування люмінесцентного аналізу в медицині і біології варто вважати введення в методику дослідження скляних фільтрів, поява кварцових ламп, а згодом і винахід зручної аналітичної лампи. Перший патент на ртутну лампу низького тиску отриманий російським професором Рєп’євим. У 1925 р. фірма "Hanay" використовувала чорне скло в аналітичній кварцовій лампі. Вітчизняна промисловість випустила кольорові скельця марки УФС, призначені для виділення ультрафіолетового випромінювання.
Із створенням компактної апаратури різко збільшилося число робіт з люмінесцентного аналізу в біології і медицині. Метод виявився особливо коштовним у тих випадках, коли характер завдань, що вирішуються, вимагав використовувати специфічні переваги люмінесцентного аналізу й у першу чергу його велику чутливість.
З 20-х років ХХ ст. посилено розвивається наукове вивчення власного світіння (первинної люмінесценції) біологічних тканин.
У цей період дослідники користалися найбільш простим і легко доступним прийомом - безпосереднім спостереженням люмінесценції досліджуваного об'єкту.
Оскільки теоретичні уявлення про люмінесценцію ще тільки формувались, те і розвиток люмінесцентного аналізу в хірургії йшло в основному методом експериментів. У цей період широко вивчається власне світіння тканин і органів, вилучених при операції. Відкрите положення і доступність зовнішніх покривів дозволили досліджувати патологічні процеси, що локалізуються в шкірі.
Вторинна люмінесценція з'являється після фарбування тканин організму спеціальними барвниками - флуорохромами. Флуорохром, уведений в досліджуваний об'єкт у незначних кількостях, значно підсилює світіння і додає йому характерний колір. Вторинна люмінесценція відкриває великі перспективи для дослідження багатьох захворювань людини, хімічних компонентів клітки і міжклітинної речовини.
У 50-х роках зникли сумніву щодо надійності люмінесцентного методу. Конкретні методики стали розроблятися на високому теоретичному рівні з використанням сучасної апаратури, виявилися можливості і перспективи цього методу в медицині. Висловлено позитивні думки про застосування вторинної люмінесценції в різних галузях хірургії.
Успіх сучасного люмінесцентного дослідження значною мірою пов'язаний із застосуванням флуоресцеїну, а ефективність люмінесцентного дослідження – з можливістю створення достатньої концентрації флуорохрому в ураженій тканині. Останнє ж залежить від способів уведення флуорохрому, тому що кожний з них у неоднаковому ступені забезпечує досягнення необхідної концентрації препарату у вогнищі ураження й у крові.
Варто сказати, що в різні періоди часу хірурги використовували при вивченні вторинної люмінесценції місцеве зрошення флуорохромом досліджуваних поверхонь для виявлення поверхневих виразок, пероральне і парентеральне введення препарату. Флуорохроми вводили в просвіт порожнистих органів, у тканину, у спинномозковий канал.
На початку ХХ ст. дослідники вивчали фізіологічні процеси, що відбуваються в організмі піддослідних тварин, і анатомічну будову нормальних органів. Потім в експерименті намагалися моделювати патологічні явища.
У 40-і роки дослідження в області застосування вторинної люмінесценції поширилися на вивчення фізіологічного стану органів і систем у людини, вивчалися тканини й органи, вилучені під час операції, але з прижиттєвим флуорохромуванням їх.
У 70-і роки вітчизняні і закордонні дослідники показали, що стійкі результати з найбільшою діагностичною значимістю для хірурга можуть бути отримані лише при проведенні прижиттєвих люмінесцентних досліджень.
Якщо люмінесцентні дослідження відкритих частин тіла у хворих з хірургічною патологією (варикозне розширення вен нижніх кінцівок) створювали враження, що питання про діагностичну значимість методу вирішене, то в останні десятиліття виникла одна із серйозних проблем - вивчення застосування люмінесцентного методу дослідження як інтраопераційного методу діагностики. Зупинимося на загальній характеристиці напрямків люмінесцентних досліджень у хірургії.
Люмінесцентний аналіз найбільш ефективний у діагностиці і при визначенні прогнозу судинних захворювань кінцівок. Ланге і Бойд, Крізмон і Фурман, а також С.М. Луценко, використовуючи внутрішньовенне введення флуоресцеїну, вивчали кровопостачання в хворих облітеріруючим ендартеріїтом.
Введення флуоресцеїну в стегнову артерію дозволяє також значно краще визначити ступінь порушення кровопостачання кінцівок при облітеріруючому ендартеріїиті й атеросклерозі, діагностувати артеріальну емболію, передбачючи можливість розвитку гангрени, прогнозувати доцільність і ефективність симпатектомії.
При варикозному розширенні вен нижніх кінцівок і тромбофлебітах люмінесцентний метод використовується для дослідження коллатерального кровообігу й умов кровообігу в області трофічних варикозних виразок, визначення точних границь активованих навколишніх тканин при поверхневих тромбофлебітах.
Метод з успіхом застосовується в нейрохірургії: у діагностиці запальних процесів головного мозку і мозкових оболонок. Г.М. Локтіонов, а також закордонні вчені використовували прижиттєве флуорохромірування для виявлення пухлин мозку під час операції. Г.Д. Князєва й ін. вивчали стан гемато-энцефалічного бар'єру при повітряній емболії мозку під час операції на серце, використовуючи флуоресцентний індикатор. Хофман і ін. повідомили про механізм проникнення флуоресцеїну через гемато-энцефалічний бар'єр.
Після операцій шкірної пластики люмінесцентний метод допомагає визначити повноцінність кровопостачання на ранньому етапі.
Показана ефективність люмінесцентного методу при ранньому визначенні некрозу тканин і його глибини при відмороженні. Так, М.Л.Лущицкий встановлював границю некротичних тканин у середньому на 3-4 дня раніш, ніж це вдається клінічно.
У грудній хірургії люмінесцентний метод здобуває практичне значення при операціях на легені і у визначенні зон ішемії при інфаркті міокарда.
У лор-хірургії люмінесцентний аналіз знайшов дуже широке застосування в діагностиці цілого ряду патологічних процесів.
Вивчаються можливості люмінесцентного методу в індикації пухлин.
У 1966 р. з'явилися наші публікації, що стосуються люмінесцентних операційних досліджень порожнистих органів черевної порожнини.
Були приведені дані досліджень, що відбивають фізичні основи і розробку технічних прийомів люмінесцентних досліджень під час операцій.
Вперше в літературі були опубліковані результати люмінесцентних досліджень порожнистих органів, що дозволили застосувати в наступному метод у клініці з діагностичною метою.
Серед інших досліджень заслуженим успіхом стала користуватися люмінесцентна мікроскопія, що відноситься до більш тонких методів вивчення структури, біофізико-хімічного і функціонального стану клітки.
Люмінесцентний метод дозволяє виявляти кислі мукополісахариди і різні компоненти тканин, зокрема альдегіди і кетони, глікоген, жир, кальцій.
Люмінесцентний аналіз набув широкого застосування в санітарії і гігієні, судовій медицині, а також у фармакології.
3. Апаратура
Апаратура для макролюмінесцентних досліджень повинна бути портативної, зручний, повинна забезпечувати проведення діагностичних спостережень у будь-яких умовах, мати оптико-світлотехнічну систему для концентрації випромінювання на визначену ділянку досліджуваної поверхні тіла хворого. Були виготовлені люмінесцентні освітлювачі, придатні для дослідження різних анатомічних областей.
При анатомо-експериментальних дослідженнях застосували люмінесцентний освітлювач, що складається з джерела ультрафіолетового випромінювання з приладом включення і світлофільтра. Апарат зміцнювався на штативі. Як джерело ультрафіолетового світла використовувалася пряма ртутно-кварцова лампа високого тиску ПРК-4.
Протягом перших 10 хв. після включення такої лампи електричні параметри її змінюються (несталий режим), а потім стабілізуються (сталий режим) при постійній напрузі мережі. Лампа при горінні знаходиться в горизонтальному положенні, відхилення не перевищували 15°, при великих відхиленнях перегріваються катоди і скорочуються терміни горіння лампи.
Лампу поміщали в кожух з дюралюмінію зі спеціальним тубусом, що має вікно для світлофільтра. Кожух із ртутно-кварцовою лампою зміцнювали на довгому чи короткому штативі.
Експлуатувалася лампа тільки з приладом включення. Прилад включення взятий від настільної ртутно-кварцової лампи. Щоб уникнути перегріву лампи і світлофільтра прилад періодично виключали для охолодження. Повторні включення лампи можливі тільки через 10-15 хв. Швидкість охолодження лампи залежить від температури навколишнього повітря.
Використовували світлофільтри УФС-3 і УФС-4, що затримують видиме світло і пропускають визначений спектр ультрафіолетових променів. УФС-3 виділяє промені в спектрі від 320 до 390 ммк, а УФС-4 - 340-390 ммк. Світлофільтр закриває вікно висувного тубуса і розташовується на відстані 25 див від лампи. Розмір скелець 100x100 мм, товщина скла 5 мм.
Створена установка виявилася зручної і для дослідження хірургічних об'єктів, тому що давала вузький пучок фільтрованого ультрафіолетового світла, направляється легко на операційне поле. Несприятливого впливу на зір установка не робила: металевий кожух на лампі захищає шкірні покриви й очі людини.
У результаті широкого впровадження люмінесцентних досліджень у клініці стало необхідним використовувати більш могутні джерела ультрафіолетового випромінювання, щоб рівномірно висвітлювати великі поверхні досліджуваного об'єкта. Для цього в клініці загальної хірургії змонтували люмінесцентний освітлювач на базі ртутно-кварцового випромінювач ОРК-21.
При застосуванні люмінесцентного дослідження зустрілися в клініці з рядом технічних труднощів. Вони були обумовлені насамперед глибоким анатомічним розташуванням такого органа, як підшлункова залоза.
Аналогічні труднощі були при необхідності проведення люмінесцентного дослідження в піддіафрагмальному просторі чи просторі в малому тазі.
Тому був запропонований операційний люміноскоп, позбавлений цих недоліків.
Операційний люміноскоп складається з ебонітового корпуса рефлектора діаметром 6 см. У корпусі рефлектора установлений відбивач, виточений з алюмінієвого сплаву, і світлофільтр з увіолевого скла, що пропускає ультрафіолетові промені і поглинає видимі. Як джерело випромінювання застосована люмінесцентна ртутна лампа ЛУФ-4.
Запропонований операційний люмінескоп дозволяє одержувати вузький пучок фільтрованого ультрафіолетового світла і здійснювати люмінесцентне дослідження як підшлункової залози, так і інших органів і важкодоступних відділів черевної порожнини.
4. Фотолюмінофори
Метод люмінесцентного аналізу в медицині став більш успішно розроблятися з розвитком вивчення вторинної люмінесценції. Остання представляє світіння, що виникає після фарбування тканин спеціальними барвниками - фотолюмінофорами. Органічні фотолюмінофори, що випромінюють під дією ультрафіолетових чи променів видимої частини спектра, часто називають флуоресцентними барвниками, чи флуорохромами.
Розглядаючи численні роботи з люмінесцентного аналізу в медицині, прийшли до висновку, що основним і самим коштовної флуорохромом є флуоресцеїн.
Флуоресцеїн (диоксифлуоран) (C20H12O5) – органічну сполуку, барвник групи трифенілметанових, червоний кристалічний порошок, розчиняється в спирті, ефірі і водяних лугах. Назва "флуоресцеїн" дано сполуці тому, що в лужних розчинах він має сильну флуоресценцію (у концентраціях до 1 : 2000000).
Отримують флуоресцеїн при нагріванні фталевого ангідриду з резорцином. У лужному середовищі оптимальна концентрація його 0,8 г/л, колір флуоресценції жовто-зелений, відносна яскравість 0,26 нт.
Флуоресцеїн майже нерозчинний у воді, тому для парентерального введення цього препарату застосовують його натрієву сіль.
Флуоресцеїн - один з найбільше яскраво світних флуорохромів. Енергетичний вихід світіння при кімнатній температурі у флуоресцеина досягає 70-71%. Препарат не токсичний і усебічно вивчений експериментаторами і клініцистами. Він допущений для застосування в клініці Міжнародною фармакопеєю, фармацевтами США, Великобританії й інших країн.
Однак, даючи повну й об'єктивну характеристику препарату, слід зазначити, що він має побічні ефекти, що часом небажані і вимагають своєчасного усунення. Нудота і блювота – найбільш часті ускладнення, що виникають при люмінесцентному дослідженні з флуоресцеїном, особливо при внутрішньовенному і внутріартеріальному введенні препарату. Однак вони легко знімаються зменшенням дози препарату, уповільненням швидкості введення його в судинне русло.
У 378 експериментальних дослідженнях на тваринах яких-небудь ускладнень від введення флуоресцеїну натрію не відзначили. У клініці на 148 досліджень по вторинній люмінесценції в хворих зареєстрований лише один випадок падіння артеріального тиску, що швидко нормалізувалося після медикаментозної терапії. При цьому в трьох чоловік спостерігалися нудота і блювота при швидкому введенні в ліктьову вену 10 мол 10%-ного флуоресцеїну натрію.
Таким чином, короткий літературний огляд і наші дані дозволяють зробити висновок, що флуоресцеїн натрію дає не більше ускладнень, ніж будь-який інший неактивний препарат. Найчастіше ці ускладнення пов'язані з порушенням техніки введення препарату, в окремих випадках - з передозуванням і дуже рідко – з ідіосинкразією.
5. Визначення інтенсивності люмінесценції
При люмінесцентних дослідженнях варто проводити не тільки візуальні спостереження інтенсивності люмінесценції, але і кількісно вимірювати це. Способи реєстрації явищ люмінесценції різноманітні, але не усі рівноцінні і застосовуються в практиці. Користуються візуальним, фотоелектричною і фотографічною фотометрією.
Візуальна фотометрія являє собою метод, заснований на здатності ока визначати рівномірність чи нерівномірність яркостей двох поверхонь. При цьому точність визначення забезпечується щільним зіткненням країв порівнюваних полів і зникненням границь між ними (при рівності яркостей), а також однаковим підбором кольору поверхонь.
При фотоелектричному фотометруванні відпадає необхідність у джерелі порівняння. Метод заснований на вимірі фотоструму, сила якого прямо пропорційна потоку світла, що падає на катод чи фотоелемента фотопримножувача. Цей метод забезпечує необхідну точність, відтворюваність і швидкість виміру люмінесценції. Фотопримножувач, застосовувані у фотоелектричному фотометруванні, дозволяють підсилити фотострум у кілька мільйонів разів. При фотографічному фотометруванні використовується здатність фотопластинки (чи фотоплівки) створювати на поверхні рівномірну освітленість при влученні на неї протягом рівних проміжків часу двох світлових потоків однакового спектрального складу. Однак варто сказати, що фотографічна фотометрія усе ще залишається трудомістким методом і, природно, обмежується її поширення. Перевагою ж її є можливість шляхом збільшення часу експозиції домогтися достатнього почорніння фотопластинки і здійснити виробництво фотознімків як документи при малій яскравості об'єктів.
На першому етапі роботи результати люмінесцентних досліджень оцінювалися нами лише візуально і за допомогою фотографування.
У наступному застосували лабораторний фотометр, а також сконструювали спеціальну апаратуру для графічної реєстрації люмінесценції. При цьому стали одержувати більш точні дані, хоча метод дослідження ускладнився. Разом з тим там, де необхідно оцінити поводження різних флуорохромів у патологічній тканині, доцільно застосовувати саме цей метод.
У практичній роботі користалися візуальним лабораторним фотометром моделі ВФМ-57. Прилад дозволяє проводити виміру в області малих яркостей, причому як білих, так і кольорових поверхонь. Межі виміру малих яркостей приладу від 5-10 до -0,00003 нт. Верхня межа виміру високих яркостей до 1 · 106 нт у "кольоровому" світлі і до 5 · 106 нт у "білому" світлі.
Погрішність виміру залежить від яскравості і кольору вимірюваної поверхні і від умов виміру і складає: у "білому" світлі 1:5 %; у "кольоровому" світлі 2:10%.
Принцип дії приладу заснований на візуальному порівнянні яскравості двох фотометричних полів, з яких одне - вимірюване, інше - поле порівняння. Для реєстрації яскравості кольорових поверхонь до приладу додається набір з дев'яти кольорових світлофільтрів. Основні вузли фотометра малих яркостей- вимірювальна голівка, стійка, що живить пристрій. Крім того, у комплект приладу входять також спеціальні насадки і пристосування. Методика роботи з фотометром проста.
Слід зазначити, що при фотометруванні прагнули до того, щоб зникли границі фотометричного поля. Коли порівнюють різнобарвні поля, то прагнуть до того, щоб вони залишалися різнобарвними, але були однаковими по яскравості. При фотометруванні високих яркостей доцільно порівнювати середнє кільце фотометричного полючи не з зовнішнім, як це рекомендується при вимірі малих яркостей, а з центральним кружком.
Для фотоелектричного фотометрування сконструювали апаратуру для графічного запису процесу фотоелектричного фотометрування. Змонтована на базі ФЗУ-54 з режимом живлення 1800 В, вона дозволяє проводити дослідження на рівні мікроциркуляції і записувати у виді графічних кривих картину світіння, що спостерігається.
Прилад складається з фіброволоконного світловоду, світлочутливого елементу (ФЭУ-54), джерела живлення й одноканального элекфокардиографа ЭКСПЧТ-4 чи самописи Н-390.
Так як прилад виготовлений за схемою підсилювача постійного току, те в ньому сигнал був поданий на передвихідний каскад для того, щоб простежити повільні зміни сигналу, що знімається з навантаження ФЭУ. Прилад реєструє картину світіння, що спостерігається, у мікроамперах і здійснює лінійний запис за допомогою електрокардіографа чи самописа Н-390.
Для вивчення люмінесцентного світіння порожнистих органів користалися також ПТУ. Ця приладу зібрана на базі прикладної телевізійної установки ПТУ-32: використана телевізійна камера КТП-40. У її склад входять телевізор, телевізійний осциллограф СІ-57 і джерело живлення з напругою 0-20 В. В установці застосовуються два світловода (фіброволоконна оптика), один з них звернений до об'єкту, на другий ж падає світло від лампи накалювання, напруга якого міняється від 0 до 20 В. Результати світіння реєструвалися фотоелектронною установкою.
Л і т е р а т у р а :
1. Полянський Б.А. Люминесцентное исследование органов и систем, - «Наука», Новосибирск, - 1983р.
2. Большая медицинская энциклопедия.