Питательные среды. Стерилизация питательных сред и посуды
Питательные среды (ПС) должны отвечать следующим минимальным требованиям: в них должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка в такой форме, в которой микроорганизмы способны их усваивать. По количественному вкладу в построении клетки различают микро- и макроэлементы. К макроэлементам относят: C, N, H, O, S, Ca, K, Fe, P, Mg. К микроэлементам относят: Mn, Zn, Mo, Cu, Co и др. Они содержатся в основном в качестве примесей в солях микроэлементов, а также попадают в ПС из стекла лабораторной посуды, с пылью и водопроводной водой. Также многие микроорганизмы нуждаются в факторах роста. Эти вещества входят в основной состав клетки, но некоторые организмы не способны их синтезировать сами.
В микробиологической практике для выращивания микроорганизмов используют разнообразные питательные среды, которые по составу подразделяют на естественные или натуральные, полусинтетические и синтетические среды.
Натуральные среды состоят из продуктов животного и растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, кровь, молоко, вода, отвары, полученные из природных субстратов, как, например, мясо, навоз, почва и др. На таких средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как они содержат все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный состав и малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, так как не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и образования продуктов обмена по ходу развития. Натуральные среды используют для поддержания культур микроорганизмов и накопления их биомассы. Примерами натуральных сред являются: мясо-пептонный бульон (МПБ), гидролизат рыбной муки (ГРМ), бульон Хоттингера, пивное, солодовое, виноградное, яблочное, мелассное сусло, дрожжевая, картофельная, капустная среды, почва и др. При добавлении агара в ГРМ получают ГРМ-агар, в МПБ - МПА.
Полусинтетические среды в своём составе наряду с соединениями известной химической природы содержат вещества неопределенного состава. К полусинтетическим средам относят МПБ с глюкозой и фосфорнокислым калием, картофельную среду с глюкозой и пептоном, а также среды известного состава с добавкой различных факторов роста (гидролизата казеина, дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта и т. д.).
Синтетические среды – это среды, в состав которых входят известные химические соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Такие среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.
По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические (индикаторные) среды. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов и менее пригодны (или совсем непригодны) для развития других. Для выделения молочнокислых бактерий используют молочную среду или гидролизат молока.
Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды позволяют быстро отличить одни виды микроорганизмов от других. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства определённого вида. В состав таких сред часто входят красители. Например, среда Эндо используется для выделения бактерий группы кишечной палочки.
По физическому состоянию различают жидкие, плотные и сыпучие среды.
Жидкие среды применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы, а также для поддержания и хранения микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.
Сыпучие среды (отруби, разваренное пшено, свекловичный жом, почва) предназначены для хранения некоторых видов микроорганизмов, и их спор, приготовления маточного, посевного материала и поверхностного культивирования микроорганизмов.
Плотные среды используют для выделения чистых культур, для хранения культур, для диагностических целей и др. Такие среды получают путем добавления в жидкие среды уплотнителей.
Уплотнители питательных сред. Для уплотнения сред применяют агар- агар, желатин и кремнекислый гель (селикагель).
Агар-агар – это сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей. Большинство микроорганизмов не использует его в качестве питательного субстрата. В воде агар-агар образует гели, плавящиеся при 100° С, затвердевающие при температуре около 40° С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы практически при любой подходящей для их роста температуре. Чаще всего агар-агар добавляют в жидкие среды в количестве 1,5-2 %.
Желатин – это белок, получаемый путём вываривания костей и хрящей животных. Его используют, главным образом, для выявления протеолитической активности микроорганизмов, а также получения глубинных колоний дрожжей с целью их идентификации. Желатин добавляют к жидким средам в количестве 10-15 %.
Кремнекислый гель применяют как твёрдую основу для синтетических сред. Готовят его путём смешения равных объёмов соляной кислоты и жидкого стекла (Na2SiO3). Добавляют к средам в количестве 1-1,5 %.
Стерилизацией (sterilis – бесплодный) называют полное освобождение какого-либо объекта (питательная среда, посуда и др.) от всего живого, в том числе, от спор. Существуют физические, механические и химические методы стерилизации.
Физические методыстерилизацииоснованы наприменении высоких температур, ультрафиолетового облучения.
Прокаливаниев пламени горелки применяется для поверхностной стерилизации негорючих и теплоустойчивых предметов непосредственно перед их использованием (препаровальные иглы, бактериологические петли, стеклянные палочки, пинцеты, предметные и покровные стёкла). После прокаливания охлажденные предметы сразу используются, их нельзя класть на стол и следует держать так, чтобы они не касались других предметов.
Кипячение используют для обработки инвентаря и посуды. Добавление 1-2 % соды значительно повышает стерилизующее действие кипящей воды.
Фламбирование используют для обработки поверхностей посуды, столов и инструментов непосредственно перед использованием.
Суховоздушная стерилизацияпроизводится в электросушильном шкафу. Сухим жаром стерилизуют пипетки, чашки Петри, пробирки, шпатели и т. д., завернутые в бумажные салфетки.
Стерилизацию ультрафиолетовым облучением проводят с помощью бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей различных помещений (боксов, микробиологических лабораторий и др.). Ввиду неблагоприятного действия УФ-лучей на организм человека бактерицидные лампы включают только при отсутствии людей в помещении.
Пастеризация – неполная стерилизация производится нагреванием до 50-60° С в течение 15-30 мин или до 70-80° С в течение 5-10 мин с последующим охлаждением до 10-11° С. Применяется для инактивации вегетативных клеток микроорганизмов в продуктах, которые при воздействии более высоких температур теряют качество и питательную ценность: (молоко, пиво, соки и т. п.).
Автоклавирование – наиболее надёжный и широко используемый способ стерилизации, осуществляемый в автоклаве. Автоклав представляет собой металлический двустенный сосуд, способный выдерживать высокое давление. Внутренняя часть – стерилизационная камера, которая окружена водопаровой камерой, имеющей кран для выхода воздуха и пара. При стерилизации в водопаровую камеру наливают дистиллированную воду до необходимого уровня. Внутрь стерилизационной камеры на специальную подставку помещают стерилизуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними. Крышка автоклава герметично закрывается (рис. 2).
Рис. 2. Схема автоклава: 1 - стерилизационная камера; 2 - кран для выхода воздуха и конденсата; 3 - манометр; 4 - предохранительный клапан; 5 - водопаровая камера; 6 - воронка для заполнения автоклава водой; 7 - отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру; 8 - крышка автоклава; 9 - подставка для размещения стерилизуемых материалов.
Химические методы стерилизации применяются для дезинфекции. Дезинфекция – это способ уничтожения микроорганизмов при помощи сильнодействующих химических веществ (антисептиков), таких как хлорная известь, йод, этиловый спирт и др. В лабораторной практике методы дезинфекции применяют для обезвреживания рабочего стола, рук, боксов.
Механические методы стерилизации применяются в тех случаях, когда субстраты не выдерживают нагревания и воздействия химических веществ (белки, сыворотки, антибиотики, витамины и др.). Осуществляется фильтрованием через специальные мелкопористые бактериальные фильтры.