ОЦЕНКА, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ
Специальные исследования свидетельствуют, что частота отклонений от нормы у яйцеклеток, выделившихся во время суперовуляции, более высокая, чем при овуляции у животных без гормональных обработок. Поэтому после суперовуляции оплодотворяются не все яйцеклетки, а из оплодотворившихся яйцеклеток не всегда развиваются полноценные зародыши, пригодные к пересадке. В связи с этим для достижения высоких результатов отбирают зародышей, способных к дальнейшему развитию в организме реципиента. Наиболее широкое распространение получили способы оценки качества и жизнеспособности зародышей по морфологическим признакам и по результатам их культивирования.
Морфологическую оценку зародышей проводят с использованием инвертированного микроскопа МБИ-13. При этом учитывают соответствие стадии развития зародыша его возрасту, целостность и форму прозрачной оболочки, равномерность дробления бластомеров и состояние их цитоплазмы, величину и прозрачность перивителлинового пространства. Зародыши с признаками дегенерации, уродств и недоразвития для пересадок непригодны. (Подробно методика изложена в «Практикуме по аку
шерству, гинекологии и искусственному осеменению сельскохозяйственных животных».)
После морфологической оценки зародышей до пересадки можно кратковременно хранить в термостате при температуре 37 "С. При этом их помещают на часовое стекло в 0,5 мл среды Дюль- бекко с добавлением 20 % фетальной сыворотки теленка или сыворотки овцы. Часовые стекла с зародышами ставят в чашки Петри, на дно которых кладут увлажненную фильтровальную бумагу. Таким образом сохраняется жизнеспособность зародышей и обеспечивается возможность более точного выявления их полноценности.
Для замораживания зародышей готовят среду из следующих компонентов (в г/л): натрия хлорид 8,0; калия хлорид 0,2; гидроортофосфат (динат- рийфосфат) безводный 1,15; дигидро- ортофосфат (монокалийфосфат) одно- замещенный 0,2; магния хлорид, содержащий 6 молекул воды, 0,1; калия хлорид безводный 0,1; натрия пируват 0,076; глюкоза 1,0. В этот раствор добавляют 20 % фетальной сыворотки крови теленка и 100 тыс. ЕД/л пенициллина (калиевой соли). Среду готовят в стерильных условиях в день применения. Часть среды используют для приготовления рабочего раствора (к 8 мл среды добавляют 1000 ЕД пенициллина и 2 мл фетальной сыворотки). Затем готовят серию растворов с разной концентрацией глицерина по методике, изложенной в инструкции, и насыщают зародыш глицерином одно- или многоступенчатым способом. Этот процесс контролируют под микроскопом в стерильных условиях при температуре 20 "С, после чего зародыши сразу замораживают в стеклянных пробирках или ампулах, пластиковых соломинках, которые маркируют.
Охлаждение проводят в несколько этапов: 1) снижают температуру от 20 "С до минус 5—7 °С со скоростью 1—10 °Св 1 мин; 2) при минус 6—7 "С проводят искусственную кристаллизацию, касаясь пинцетом, переохлажденным в жидком азоте, поверхности контейнера с зародышами; 3) продолжают охлаждать со скоростью 0,3 °С в 1 мин до минус 36 °С; 4) погружают в жидкий азот для быстрого охлаждения до минус 196 °С. Хранят замороженные эмбрионы в сосудах Дьюара. Для оттаивания емкости с зародышами быстро переносят в водяную баню с температурой 25—37 °С и держат до исчезновения льда.
Вместе с раствором криопротектора эмбрион помещают на часовое стекло, предварительно оценивают под лупой и удаляют криопротектор, помещая зародыш в заранее приготовленные растворы глицерина убывающей концентрации. Затем еще раз оценивают качество зародышей под микроскопом. Когда эмбрионов замораживают в соломинках с раствором глицерина и сахарозы, то после оттаивания соломинку несколько раз встряхивают (подобно термометру). При этом пробка, закрывающая соломинку, должна быть направлена вверх. Для уравновешивания осмотического давления и удаления криопротектора из зародыша соломинку помещают вертикально (пыжом вверх) в водяную баню с температурой 25—37 °С. Затем приступают к пересадке эмбриона (Н. И. Сергеев, С. А. Мазепкин).
Разработаны и другие способы культивирования зародышей вне организма, позволяющие сохранять их жизнеспособность до 24—48 ч. Зародышей можно культивировать в пробирках, а также в ампулах и пайетах из поливинилхлори- да. До 4—7 дней сохранить их можно в перевязанном яйцепроводе кролика. Однако наиболее перспективным методом является глубокое замораживание зародышей в жидком азоте при температуре минус 196 °С. Зародыши крупного рогатого скота лучше других переносят замораживание и размораживание; выживаемость — 50—70 %.
Реципиент — животное, которому трансплантируют (пересаживают) в матку одного или двух зародышей на ранней стадии их развития. После пересадки в организме реципиента должны быть обеспечены оптимальные условия для дальнейшего развития зародыша и рождения жизнеспособного плода. Реципиентов отбирают в количестве 6—8 гол. на каждого донора из числа животных, не имеющих большой племенной ценности. При этом используют телок в возрасте 16—18 мес с массой 350—380 кг или коров не старше 7 лет. Животные должны быть здоровыми, без признаков нарушения обмена веществ. Успех пересадок в значительной степени зависит от физиологически полноценного течения половых циклов и правильного определения охоты у реципиентов. Необходимо тщательно контролировать течение последних двух половых циклов и все дальнейшие показатели регистрировать в соответствующей документации (календарь полового цикла). Половые циклы должны протекать регулярно, быть полноценными, с синхронным формированием стадии возбуждения. Животных с нерегулярными, неполноценными половыми циклами, с ненормальной продолжительностью отдельных феноменов стадии возбуждения полового цикла исключают из числа реципиентов. Реципиенты должны быть в состоянии средней упитанности, с хорошим физическим развитием, иметь крупный, правильной формы таз. Яичники и матка должны быть нормально развиты, без патологических изменений.
| ОТБОР РЕЦИПИЕНТОВ |
Отобранных реципиентов еще раз обязательно обследуют перед трансплантацией зародышей. Яичники должны быть типичными для соответствующей стадии полового цикла, без кист. Уточняют степень развития и положение желтого тела.