ТЕМА : АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

ОПЫТ 1.ГИДРОЛИЗ БЕЛКА

Принцип метода. Анализ аминокислотного состава белка проводят после его гидролиза кислотой или щелочью. Пептидная связь является ковалентной и химически устойчивой, поэтому гидролиз проводят в жестких условиях.

Ход работы. При проведении кислотного гидролиза белок кипятят в растворе 6 М НСl при 105° С в течение 24 час. в запаяных ампулах под вакуумом.

Образовавшийся гидролизат используют в дальнейших опытах.

ОПЫТ 2. РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Цель работы: Анализ гидролизата белка методом бумажной хроматографии в присутствии маркеров. Определение коэффициента распределения аминокислот.

Принцип метода. Это метод распределительной хроматографии. Основан на различии растворимости аминокислот в двух несмешивающихся жидкостях: вода (неподвижная фаза, так как зафиксирована на хроматографической бумаге ) и органический растворитель ( фенол, изобутиловый или бутиловый спирт). Скорость перемещения аминокислот по бумаге зависит от степени их растворимости в подвижной и неподвижной фазах и может характеризоваться величиной Rf .

Rf = а / b ,

где а - расстояние, пройденное аминокислотой. b - расстояние, пройденное растворителем.

Коэффициент Rf является величиной, характерной для каждой аминокислоты и постоянной при данных условиях опыта.

Бумажная хроматография бывает восходящая, нисходящая и круговая. Для быстрого разделения аминокислот можно использовать метод круговой хроматографии на бумаге.

Ход работы. Диск хроматографической бумаги радиусом 9-10 см разделить на 4 сектора путем сгибания. Из середины диска провести карандашом окружность радиусом 1 см. На середину каждой полученной дуги нанести 1 каплю (0,002 мл) раствора гидролизата или аминокислоты и высушить на воздухе. Диск поместить между двумя половинками чашки Петри, нижняя из которых наполовину заполнена растворителем. Сделать из фильтровальной бумаги фитилек и вставить его верхний конец в центр хроматографического диска, а нижний поместить в расворитель. Когда граница растворителя достигнет краев чашки Петри, хроматографическую бумагу снимают и высушивают при 70-80° С для удаления растворителя.

Для окрашивания хроматограмму быстро проводят через ванночку с раствором нингидрина и высушивают при 80-100° С в сушильном шкафу. На хроматорамме появляются окрашенные пятна на месте аминокислот.

Результаты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выводы:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2.

ТЕМА: КАЧЕСТВЕННЫЕ ( ЦВЕТНЫЕ) РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

Цветные реакции на белки являются реакциями на функциональные группы радикалов аминокислот, входящих в состав белков.

ОПЫТ1 . ПОЛУЧЕНИЕ РАСТВОРА ЯИЧНОГО АЛЬБУМИНА

Цель метода: Анализ растворов на принадлежность к белковым веществам и сравнение их по аминокислотному составу.

Принцип метода: Яичный белок – это 10%-водный раствор нескольких белков без заметных примесей углеводов и липидов. Альбумин в яичном белке составляет 70% и легко отделяется путем 10-кратного разведения дистиллированной водой.

Ход работы: 20 мл яичного белка разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:10 при постоянном помешивании стеклянной палочкой. Яичный альбумин остается в растворе, а белки глобулиновой фракции выпадают в виде хлопьевидного осадка, который отфильтровывают через бумажный фильтр.

Результат: Полученный раствор яичного альбумина используют в дальнейших опытах.

ОПЫТ №2. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ

Принцип метода: Пептидные группы белков и пептидов (- СО - NH- ) в щелочной среде образуют комплексные соединения с ионами меди (Сu²⁺ ). Раствор окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую – 5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. Далее в каждую пробирку добавляют по 3 капли NaOH и по 1 капле CuSO4. Пробирки встряхивают. Наблюдают за изменением окраски.

Результаты: I пробирка_________________________________

II пробирка _________________________________________________

III пробирка__________________________________________________

Выводы____________________________________________________________________________________________________________

ОПЫТ 3. НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА АЛЬФА-АМИНОГРУППЫ

Принцип метода: Нингидрин вступает в реакцию с концевыми -аминогруппами белков, пептидов или аминокислот. Продукты этой реакции окрашены в сине- фиолетовй цвет.

Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую-5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель раствора нингидрина. Кипятят 2 минуты на водяной бане. Следят за изменением окраски.

Нингидриновая реакция применяется для обнаружения белков, пептидов и аминокислот в растворах.

Результаты:

I пробирка_______________________________________________________________________

II пробирка _____________________________________________________________________

III пробирка_____________________________________________________________________

Выводы___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ОПЫТ 4. КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ЦИКЛИЧЕСКИЕ АМИНОКИСЛОТЫ

Принцип метода: Радикалы аминокислот, имеющие в своем составе бензольное кольцо (фен, тир, трп) вступают с азотной кислотой в реакцию нитрования. Продукты реакции окрашены в желтый цвет.

Ход работы: Берут три пробирки: в одну вносят 5 капель раствора белка, в другую – 5 капель гидролизата, в третью 5 капель желатина. Затем в каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты (HNO₃ – агрессивная жидкость!). Кипятят 2 минуты на водяной бане. Регистрируют изменение цвета.

Результаты:

I пробирка_______________________________________________________________________

II пробирка _____________________________________________________________________

III пробирка_____________________________________________________________________

Выводы___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ОПЫТ 5. РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА НА ТИРОЗИН

Принцип метода: Фенол с солями ртути дает красное окрашивание. Тирозин, имеющий фенольную группу в радикале, также дает красное окрашивание при реакции с солями ртути.

Ход работы Берут четыре пробирки: в первую вносят 10 капель раствора белка, во вторую – 10 капель гидролизата, в третью – 10 капель желатина, в четвертую – 10 капель раствора фенола. В каждую пробирку добавляют по 5 капель реактива Миллона (смесь солей ртути в концентрированной азотной кислоте). Кипятят 5 минут. Регистрируют изменение окраски.

Результаты:

I пробирка_______________________________________________________________________

II пробирка _____________________________________________________________________

III пробирка_____________________________________________________________________

IV пробирка_____________________________________________________________________

Выводы___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

ТЕМА: ФИЗИКО – ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

ОПЫТ № 1. ВЫДЕЛЕНИЕ КАЗЕИНА ИЗ МОЛОКА

Принцип метода: В молоке содержится специфический белок казеин, содержащий фосфор. 80% всех белков молока приходится на долю казеина. Этот белок обладает кислыми свойствами и находится в молоке в виде растворимой кальциевой соли. При подкислении казеин выпадает в осадок в виде белых рыхлых хлопьев, которые фильтрованием отделяются от раствора.

Ход работы: В стакан ( 50 мл ) отмеряют 3 мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. После перемешивания добавляют 10 мл 1% HCl, т.к. в избытке соляной кислоты осадок казеина растворяется. Перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут до образования рыхлого осадка.

Для удаления соляной кислоты в стакан приливают 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с осадка. Процедуру повторяют. Осадок фильтруют через бумажный фильтр.

ОПЫТ № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ КАЗЕИНА

Принцип метода: Белки являются амфотерными электролитами, поэтому диссоциируют с образованием как положительно, так и отрицательно заряженных групп. При определении pH среды можно добиться такого соотношения ионизированных групп, при котором белковый раствор наименее устойчив и белок выпадает в осадок.

Ход работы: В 5 пробирок приливают из бюретки следующие количества 0,1 н. раствора уксусной кислоты: в первую – 0,25 мл; во вторую – 0,5 мл; в третью – 1,0 мл; в четвертую – 2,0 мл; в пятую – 4,0 мл. Из другой бюретки в той же последовательности в каждую пробирку прибавляют 8,75 мл; 8,5 мл; 8,0 мл; 7,0 мл и 5,0 мл воды.

В каждую из пробирок приливают пипеткой по 1 мл раствора казеина и наблюдают за степенью помутнения раствора.

№ п/п	Реактив
	0,1 н. р-р CH₃COOH	0,25	0,5	1,0	2,0	4,0
	Вода	8,75	8,5	8,0	7,0	5,0
	0,4% р-р казеина	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
	pH
	Степень помутнения

Результаты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выводы___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ОПЫТ №3. ОСАДОЧНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

3.1. Осаждение белков при кипячении.

Принцип метода. Для осаждения белка необходимо разрушить его гидратную оболочку и нейтрализовать его заряд. При кипячении происходит денатурация, разрушается гидратная оболочка. Белок теряет заряд, если pH раствора близок к изоэлектрической точке этого белка.

Ход работы. В 5 пробирок вносят по 5 капель раствора яичного белка. Затем добавляют:

во вторую пробирку – 1 каплю уксусной кислоты;

в третью – 10 капель уксусной кислоты;

в четвертую – 5 капель уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора хлорида натрия;

в пятую – 2 капли гидроксида натрия.

Все пробирки кипятят 5 минут в водяной бане.

Результаты:

№ пробирки	Реакция среды	Наличие факторов стабилизации
Гидратная оболочка (есть/нет)	Заряд (есть «+» или «-»/ нет)
1.	Нейтральная
2.	Слабокислая
3.	Сильнокислая
4.	Кислая + электролит
5.	Щелочная

Выводы:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3.2. Осаждение белка ацетоном

Ход работы. В пробирку наливают 5 капель раствора белка, затем добавляют 0,5 мл ацетона, осторожно наслаивая по стенке пробирки.

Результаты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выводы:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3.3. Осаждение белков спиртом

Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора белка, добавляют несколько кристаллов хлорида натрия (NaCl ) и приливают 5 мл этилового спирта.

Результаты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выводы:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3.4. Осаждение белка органическими кислотами

Принцип метода: органические кислоты, такие как трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты, вызывают денатурацию и осаждение белка.

Ход работы: В пробирку наливают 5 капель раствора белка, затем добавляют 3 – 4 капли 8% трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH ).

Результаты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выводы:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3.5. Осаждение белка концентрированной азотной кислотой

Принцип метода: Концентрированная азотная кислота вызывает денатурацию белка и его осаждение. Осадок белка не растворяется в избытке азотной кислоты.

Ход работы: В пробирку вносят 10 капель концентрированной азотной кислоты, затем осторожно из пипетки наслаивают по стенке пробирки примерно 1 мл раствора белка так, чтобы жидкости не смешивалтсь.

Результаты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выводы:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3.6. Осаждение белка солями тяжелых металлов

Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора белка, осторожно, по каплям при встряхивании добавляют раствор сульфата меди (CuSO ).

Результаты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выводы:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ОПЫТ № 4. ФРАКЦИОННОЕ ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ

Принцип метода:

Ход работы: К 1 мл неразбавленного яичного белка добавляют 6 мл воды. Образунтся небольшое количество белого хлопьевидного осадка глобулинов. Глобулины могут растворяться в слабых растворах солей и не растворяются в дистиллированной воде.

В пробирку наливаем несколько капель насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄, после чего происходит растворение выпавшего глобулина.

К 1 мл данного раствора яичного белка. Содержащего альбумины и глобулины приливаем 1 мл насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄. Выпадает осадок глобулинов. Который удаляется фильтрованием.

К фильтрату добавляем кристаллический сульфат аммония до полного насыщения. Образуется осадок яичного альбумина. Который всплывает вверх вследствие высокой плотности жидкости. Осаждение белков солями является обратимым процессом и при добавлении воды белки снова растворяются.

Результаты опыта и выводы оформляют в виде таблицы:

Название белка	Степень насыщения (NH₄)₂SO₄	Результаты опыта	Выводы
Яичный белок	50%
Яичный белок	100%

ОПЫТ № 5. ДИАЛИЗ БЕЛКОВ

Принцип метода: Очень удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей, например от избытка солей после высаливания, является диализ.

Диализом называют процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и т.д.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.

Ход работы: В пробирку наливают 1 мл раствора яичного альбумина и прибавляют к раствору 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, переносят в пробирку и растворяют физиологическим раствором.

Из листа целлофана, предварительно смоченного дистиллированной водой, делают мешочек (диализатор) и выливают в него содержимое пробирки.

Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновыми колечками, надетыми на концы палочек. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, укладывая палочки, зажимающие мешочек, на края стакана. Необходимо проследить за тем, чтобы уровень жидкости в мешочке был ниже уровня жидкости в стакане.

Через 1 час после диализа берут в две пробирки по 1 мл жидкости из стакана и проделывают две реакции:

а) на присутствие SO₄^2-: добавляют в первую пробирку 3 – 4 капли 5%-ного раствора BaCl₂ .

б) на присутствие белка: проделывают биуретовую реакцию.

Жидкость из мешочка сливают в пробирку ( диализат), отмеривают 10 капель диализата и с ним тоже проделывают биуретовую реакцию.

Результаты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выводы:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________