Микроскопия в световом оптическом микроскопе.

Практикум: Микроскопическое изучение живых (нативных) и окрашенных микробов.

Задание1: законспектируем содержание практикума в тетради и зарисуем рисунки:

Микроскопический метод в микробиологии. Методические основы.

Световой микроскоп состоит из механической и оптической части. Механическая часть микроскопа - это штатив, состоящий из основания и колонки, к которой прикреплены тубус и предметный столик. В колонке имеются две винтовые системы для установки тубуса. Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объективов и окуляров. Осветительный аппарат расположен под предметным столиком. В большинстве микроскопов свет отражается от зеркала (см.рисунок) и, пройдя через линзы конденсора, фокусируется в плоскости препарата. В современных микроскопах освещение достигается с помощью вмонтированного в микроскоп источника света. Объективы представляют собой систему линз в металлической оправе. Передняя (фронтальная) линза - самая маленькая. От нее главным образом зависит увеличение микроскопа. Расположенные за ней линзы называются коррекционными, так как они предназначены для устранения недостатков оптического изображения. При микроскопии объектив погружают в каплю масла, поэтому объектив называют иммерсионным объективом (лат. immercio - погружение), а масло - иммерсионным маслом. Иммерсионный объектив требует особо осторожного обращения. Фронтальная линза имеет настолько короткое фокусное расстояние до исследуемого объекта, что опускать объектив нужно медленно, глядя сбоку, чтобы не раздавить препарат, что связано с порчей линзы. Окуляры имеют две линзы: верхняя называется глазной, а нижняя - собирательной. Окуляры обозначают по тому увеличению, которое они дают, например: х7, х10, х15 и т.д. Предел разрешения оптического микроскопа равен 0,2 мкм.

Клетки микроорганизмов в живом состоянии изучают методом раздавленной капли иметодом висячей капли.

Метод раздавленной капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом х40. Метод раздавленной капли удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также для изучения крупных микроорганизмов - плесневых грибов, дрожжей и т.п.

Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. Затем предметное стекло с лункой прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат.

Окраска микроорганизмов — комплекс методов изучения структуры и морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур или исследуемого материала.

Фиксированные бактерии окрашиваются лучше живых, так как клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана живой клетки ограничивают проникновение в нее красителя.

Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов:

1) приготовление мазка;

2) высушивание мазка;

3) фиксацию мазка;

4) окраску;

5) высушивание.

Мазок готовят на чистых предметных стеклах, на середину которых наносят небольшую каплю воды и в нее с помощью бактериологической петли помещают исследуемый материал. Материал распределяют на стекле равномерным тонким слоем, размер мазка —1—2 см².

Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки.

Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный — фиксация жаром — нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта и эфира — по Никифорову).

После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2—5 мин.) краску сливают и препарат промывают водой.

Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную — фуксин, или синюю — метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1—2 мин.), метиленовый синий — медленнее (3—5 мин.). Фуксин приготовляют в виде концентрированного карболового раствора (фуксин Циля), очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. Метиленовый синий приготовляется заранее в насыщенном спиртовом растворе, который стоек и может долго храниться.

Основные виды красителей, которые применяются в микробиологической практике:

Дают следующее окрашивание
красное	голубое (синее)	фиолетовое	желто-коричневое	зеленое
фуксин основной, нейтральный красный, конго красный	метиленовый и толуидиновый синий	генцианвиолет, метиленовый фиолетовый	хризоидин, везувин	бриллиантовый зеленый, малахитовый зеленый

Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.