ФЕРМЕНТЫ, КАТАЛИЗИРУЮЩИЕ РАЗЛОЖЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ

Г Л А В А 4

Эффективность биотехнологических процессов переработки растительных субстратов зависит от потребления трех основных компонентов: целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Деградация этих полимеров в природе осуществляется преимущественно благодаря действию специфических ферментов микроорганизмов. Способность к образованию ферментов, участвующих в разложении полисахаридов и лигнина растительных материалов встречается у различных микроорганизмов. При этом ферменты, разрушающие тот или иной компонент растительной биомассы, объединены в соответствующие ферментные комплексы: целлюлазно-гемицеллюлазный, пектиназный, лигниназный.

Большинство ферментов, входящих в состав этих комплексов, синтезируются почти всеми организмами в виде целого ряда изоферментов, отличающихся субстратной специфичностью, сродством к различным формам нерастворимого субстрата и ролью его в деструкции. Отношение между ферментами внутри комплекса являются синергическими: синергизмом называют увеличение эффективности действия двух или нескольких компонентов системы при их совместном присутствии по сравнению с суммарным проявлением действие этих ферментов по отдельности.

Имеющиеся, в настоящее время обширные данные о ферментативных системах, которые участвуют в разложении полисахаридов растительного сырья и лигнина, свидетельствуют о значительном интересе к изучению биохимических особенностей и механизмов действия ферментов, входящих в состав соответствующих ферментных комплексов, а так же о необходимости дальнейшей интенсификации этих исследований, с целью последующего использования полученных результатов в проектировании реальных экологически безопасных технологий.

Согласно номенклатуре ферментов Международного биохимического союза ферменты, катализирующие разложение растительных субстратов, принадлежат в основном к гликозилгидролазам (КФ 3.2.1), расщепляющих гликозидные связи в полисахаридах растительных клеточных стенок.Значительно ускоряют процессы разложения растительных субстратов некоторые типы эстераз (КФ 3.1.), Так, например, пектинэстеразы (пектиндеметилазы, КФ 3.1.1.11), ацетилксиланэстеразы или ферулоилэстеразы, расщепляя сложноэфирные связи между углеводным остатком гемицеллюлоз и остатком уксусной, феруловой или диферуловой кислоты, или в метиловых эфирах галактуроновой кислоты в составе пектина, разобщают сшитые диферулатными мостиками молекулы арабиноксилана и пектина, а также отделяют лигнин от полисахаридов. Среди гидролаз, действующих на компоненты растительной клеточной стенки, условно выделяют:

1. Гидролазы, расщепляющие структурно-упорядоченную часть целлюлозы. К ним относятся преимущественно целлобиогидролазы грибов и бактерий.

2. Гидролазы, расщепляющие линейные цепи в составе аморфного матрикса, окружающего кристаллиты целлюлозных фибрилл, в том числе и нековалентно связанные с целлюлозой полисахариды. К ним принадлежат эндоглюканазы, ксилоглюкан-гидролазы, эндоксиланазы, эндоманнаназы, эндо-1,3-β-глюканазы.

3. Гидролазы, отщепляющие боковые ответвления, точки связывания гемицеллюлоз и пектинов с лигнином. Это гликозидазы: α-L-арабинозидазы, α-D-глюкуронидазы, α- и β-галактозидазы, β-глюкозидазы, β-маннозидазы, α- и β-ксилозидазы, α-фукозидазы, а также эстеразы: ацетилксиланэстеразы, ферулоилэстеразы.

4. Ферменты, вызывающие мацерацию. К ним относятся эндо- и экзополигалактуроназы, β-галактаназы, α-L-арабинаназы, рамногалактуроназы, α-рамнозидазы, пектин-метилэстеразы (КФ 3.1.1.11), специфические протеазы коллагеназного типа протеогликангидролазы, которые вызывают разделение растительных клеток вдоль составной срединной пластины.

5. Гликозилгидролазы, характеризующиеся трансферазной (КФ 2.4.1) активностью и способные параллельно с гидролизом переносить отщепляемые моно-, олиго- или полисахаридные фрагменты на первичный (реже вторичный) гидроксил углеводного остатка или свободный фенольный гидроксил фенилпропаноидных структур. К ним принадлежат эндогликаназы и гликозидазы, сохраняющие конфигурацию расщепляемой связи у продуктов реакции, а также ксилоглюкан-эндотрансферазы. Они выполняют соединение частей аморфного полисахаридного матрикса, покрывающего целлюлозу и присоединение его через лигноуглеводные связи к лигнину.

В таблице 4 представлен список основных ферментов в соответствии с традиционной номенклатурой ферментов, классифицирующей ферменты по типу расщепляемой гликозидной связи.

Таблица 4

Ферменты, расщепляющие гликозидные связи в растительных полисахаридах *

*Кроме перечисленных в таблице ферментов имеются гликозилгидролазы не вошедшие в этот список: α-ксилозидаза, рамногалактуронангидролаза и др.

Современная систематика энзимов основывается не только на их субстратной специфичности, но и на структурных признаках ферментов, Это связано во-первых, с тем, что, абсолютная субстратная специфичность по отношению к типу гликозидной связи – встречается не у всех ферментов и имеются ферменты, совмещающие несколько типов активностей в одном активном центре (в частности, целлюлазы-ксиланазы), а во-вторых, молекулярные структуры ферментов с общей специфичностью весьма разнообразны и во многих случаях они сильно отличаются друг от друга. Кроме того, обнаружено множество примеров ферментов-химер, которые на С- и N-концах одной молекулы несут два активных центра различной специфичности. Примером являются целлюлолитические ферменты, которые в современной классификации составляют многочисленную группу гликозилгидролаз из 15 семейств и нескольких подсемейств.

Целлюлазы

Целлюлазы – это комплекс ферментов, включающий ферменты, которые осуществляют гидролиз целлюлозы до ее мономера путем расщепления 1,4-β-гликозидной связи между остатками D-глюкозы, а также ферменты иной специфичности или некаталитические белки, действующие на поверхности целлюлозы.

Целлюлолитические ферменты продуцируются грибами, актиномицетами, бактериями, некоторыми беспозвоночными животными и растениями. У микроорганизмов и беспозвоночных животных роль этих ферментов заключается в расщеплении целлюлозы до глюкозы, которая используется ими как источник углерода и энергии. Микроорганизмы-фитопатогены синтезируют целлюлазы для разрушения растительной клеточной стенки и проникновения в цитоплазму. Целлюлолитические ферменты растений играют важную роль в процессе роста клетки, опаде листьев, удлинении пыльцевой трубки, созревании плодов, дифференциации сосудов.

Целлюлолитическая активность обнаружена в гепатопанкреасе и кристаллическом стебельке моллюсков, переваривающем соке улиток, в слюнных железах и пищеварительных органах термитов и ряда других насекомых. Обнаруживаемая у этих организмов целлюлазная активность, в ряде случаев принадлежит микроорганизмам, живущим в их пищеварительных органах. У позвоночных животных способность усваивать целлюлозу связана с наличием целлюлолитической микрофлоры, состоящей из бактерий и микроскопических грибов.

Аэробные микроорганизмы могут секретировать практически весь целлюлазный комплекс за исключением целлобиаз, являющихся в основном внутриклеточными, в среду к субстрату. Уровень внеклеточных и связанных с клеткой целлюлаз может регулироваться путем использования различных источников углерода в питательной среде. Процессы секреции целлюлаз зависят от состояния мембран клетки и клеточной поверхности. Существует мнение о том, что наличие у целлюлаз углеводной части способствует удержанию ферментов у гиф грибов. У гриба Phanerochaete chrysosporium гифы окружены оболочкой, которая состоит из β –1,3 и β-1,4 глюкана, образующего соединительный элемент между грибом и клеточной стенкой растительного субстрата. Показано, что целлюлозоразрушающие грибы имеют одну белково-липидную мембрану, а лигнинразрушающие – две и их толщина может варьировать от вида. У анаэробов, жизнедеятельность которых происходит преимущественно в значительных обьемах жидкости, целлюлазы действуют в составе сложных надмолекулярных ансамблей – целлюлосом и полицеллюлосом.

Общая характеристика и классификация ферментов целлюлазного комплекса

Ферментная система «целлюлазы» объединяет спектр белков, способных гидролизовать полимерные молекулы целлюлозы, либо специфически связываться с ее поверхностью. К целлюлолитическим ферментам относятся целлобиогидролазы, без которых разрушить структуру упорядоченной части целлюлозы невозможно, а так же эндоглюканазы и другие ферменты, освобождающие поверхность микрофибрилл целлюлозы от сопутствующего аморфного матрикса или способствующие их освобождению (гликозидазы, ацетилксиланэстеразы, ферулоилэстеразы). Кроме того, сюда включены и некаталитические белки целлюлосом анаэробных бактерий скаффолдины, содержащие целлюлозосвязывающий домен (ЦСД), а также белки, гомологичные каталитическим доменам (КД) или ЦСД целлюлаз, и разнообразные структурные элементы, соседствующие в этих белках с КД или ЦСД.

Согласно традиционной номенклатуре к основным типам ферментов, способных расщеплять гликозидные связи в целлюлозе относятся эндоглюканазы, экзоцеллобиогидролазы, целлобиазы, экзоглюкогидролазы.

Эндоглюканазы или 1,4-β-глюкан- глюканогидролазы (КФ 3.2.1.4) - гидролизируют β -1,4-связи в β- 1,4-глюканах. Они способны с одинаковой вероятностью гидролизовать любую из гликозидных связей в молекуле целлюлозы, включая и самые крайние. Однако при достаточно высокой степени полимеризации молекулы субстрата суммарная вероятность действия эндоглюканаз на внутренние гликозидные связи будет выше, чем на две крайние связи. Поэтому, продуктами действия эндоглюканаз в основном являются фрагменты молекул целлюлозы произвольной длины. Эндо-1,4-β-глюканазы снижают вязкость растворов произ­водного целлюлозы — карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), рас­щепляя КМЦ до восстанавливающих сахаров. Продуцируют эндоглюканазы грибы, бактерии, высшие растения и некоторые беспозвоночные животные. Молекулярная масса выделенных эндоглюканаз колеблется в пределах 20-70 кДа, хотя некоторые микроорганизмы синтезируют эндоглюканазы с молекулярной массой 10-14 кДа и 140 кДа. Множественные формы эндоглю­каназ образуют грибы. В составе целлюлазного комплекса Trichoderma reesei обнаружены эндоглюканазы (EG): І (cемейство7); ІІ (семейство5); ІІІ (семейство 12); ІΥ (семейство 61); Υ (семейство 45), которые различаются молекулярной массой, изоэлектрическими точками, характером воздействия на суб­страт и вследствие этого выполняют различные функции при ферментативном разложении целлюлозы. Изучение содержания множественных форм эндоглюканаз в процессе роста культуры Geotrichum candidum показало, что состав и относительное со­держание эндоглюканаз 48, 72 и 96-часовой культуры различ­ны. Выделенные эндоглюканазы характеризовались разной спо­собностью расщеплять до сахаров КМЦ, хлопковое волокно они гидролизовали в незначительной степени, а микрокристалличе­скую целлюлозу авицел до сахаров не расщепляли совсем.

Большая часть эндоглюканаз — гликопротеины, содержат уг­леводы, ковалентно присоединенные к молекуле белка. Изуче­ние аминокислотного состава эндо-1,4-β-глюканаз грибов сви­детельствует о том, что это кислые белки, в состав которых вхо­дит большое количество дикарбоновых и оксиаминокислот.

Экзоцеллобиогидролазы или 1,4-β-глюкан-целобиогидролазы (КФ 3.2.1.91.) - действуют на вторую от конца молекулы целлюлозы гликозидную связь с образованием целлобиозы. Ферменты обладают высокой специфичностью - гидролизуют β -1,4-глюканы, но не действуют на β-1,3- и β-1,6-глюканы.

Известно два типа целлобиогидролаз - I и II. Первая гидролизует целлюлозную цепь с восстанавливающего конца по направлению к невосстанавливающему, а вторая - наоборот, начинает вести гидролиз с невосстанавливающего конца. Значитель­ная часть этих ферментов имеет молекулярную массу 30-70 кДа. Экзоцеллобиогидролазы из Trichoderma viride, Sporotrichum pulverulentum содержат большое количество кислых и гидрофобных остатков аминокислот и 16 остатков полуцистина, что указывает на жесткую структуру этих белков. В молекуле экзоцеллобиогидролазы Sclerotium rolsii остатков полуцистина не обнаружено. Многие целлобиогидролазы содержат в молекуле углеводы, в со­став которых входят глюкоза, глюкозамин, галактоза, манноза, ксилоза. Целлобиогидролаза I является основным компонентом грибных целлюлаз. Она необходима для расщепления нативной целлюлозы. При воздействии на субстрат целлобиогидролаза I сохраняет конфигурацию расщепляемой связи в продуктах реак­ции и катализирует процессы трансгликозилирования.

Целлобиогидролаза II катализирует гидролиз гликозидных свя­зей с обращением конфигурации у аномерного углерода. Спе­цифичность целлобиогидролазы II узкая — она не действует на гетерозидную связь во флуорогенных производных целлоолиго-сахаридов, не расщепляет лактозиды.

Большинство целлобиогидролаз - гликопротеины, с содержанием до 9% нейтральных углеводов, состоящих в основном из маннозы, небольшого количества глюкозы, галактозы и глюкозамина.

Целлобиазы или (глюкозидгидролазы) β – глюкозидазы (КФ 3.2.1.21) - практически не действуют на полимерные молекулы целлюлозы, но могут расщеплять короткие целлоолигосахариды, в состав которых входит до 6 глюкозных единиц, причем, с возрастанием молекулярной массы олигосахарида, катализирующая способность целлобиазы уменьшается. Многие целлобиазы не специфичны по отношению к определенному типу связи. В ходе реакции могут расщепляться и β -1,2, β -1,3, β -1,4 и β-1,6- связи. От содержания и свойств β-глюкозидаз зависит глубина расщепления целлюлозы. β-глюкозидазы продуцируют микроорганизмы, растения, жи­вотные. Расщепляя с помощью целлобиаз β-глюкозиды и олигосахариды, микроорганизмы используют глюкозу как источник углерода и энергии. У животных и растений β-глюкозидазы вы­полняют регуляторные функции. В природных источниках β-глюкозидазы встречаются как внеклеточные, так и внутриклеточные, связанные с клетками. β-глюкозидазы преимущественно индуцибельные ферменты. Мо­лекулярная масса β-глюкозидаз находится в пределах от 16 до 500 кДа, при этом почти половина имеет молекулярную массу 50-200 кДа.

Экзоглюкогидролазы или 1,4-β-глюкан-глюкогидролаза (КФ 3.2.1.74) отщепляют глюкозу от невосстанавливающего конца целлюлозной молекулы. Очень медленно гидролизует целлобиозу.

Расщепление полимерных субстратов клеточной стенки растений происходит при совме­стном действии различных типов ферментов. Так, эндоглюканазы расщепляют цепи целлюлозы в основном посередине, образуя в боль­шом количестве невосстанавливающие концы, от которых целлобиогидролазы и экоглюкогидролазы отщепляют молекулы целлобиозы и глюкозы. Образующуюся целлобиозу целлобиазы расщепляют до глюкозы.

Характерно, что продуценты целлюлаз синтезируют множест­венные формы однотипных ферментов (эндоглюканаз, экзоглюканаз, целлобиаз), которые неодинаково действуют на разные ти­пы целлюлоз, образуя те или иные продукты. Конфигурация ано-мерного гидроксила у продуктов реакции зависит от типа фер­мента, действующего на субстрат. Так, β-конфигурация ОН-групп у С-1 продукта реакции сохраняется при действии на субстрат эндоглюканаз и β-глюкозидаз. При действии на субстрат целло-биогидролаз происходит стереоспецифический процесс — аномерный гидроксил инвертируется целлобиогидролазой II, а целлобиогидролаза I сохраняет β-конфигурацию.

Целлюлолитические ферменты способны катализировать ре­акции трансгликозилирования. Трансгликозилирование — это перенос ферментом фрагмента углеводного субстрата с активно­го центра на подходящий акцептор, которым могут быть другая молекула субстрата, ее фрагмент, различные спирты. В результа­те могут образовываться продукты со степенью полимеризации большей, чем у исходного субстрата.

Экзоглюканазы наиболее упорядоченно действуют на поли­мерный субстрат и обычно образуют единственный низкомоле­кулярный продукт (например, целлобиоза для целлобиогидролаз). Эндоглюканазы, напротив, образуют несколько низкомо­лекулярных продуктов в различных соотношениях.

У некоторых грибов, осуществляющих сопряженную деграда­цию целлюлозы и лигнина, помимо целлюлолитических фер­ментов обнаружены окислительно-восстановительные фермен­ты, которые могут принимать участие в деградации высокоупорядоченных форм целлюлозы: это целлобиозооксидаза и целло-биозохиноноксидоредуктаза. Они окисляют целлоолигосахариды до целлобионолактона или после его омыления до целлобионовой кислоты. Целлобиозооксидаза использует в качестве акцеп­тора электронов кислород, восстанавливая его до H₂О₂. Целло-биозохиноноксидоредуктаза окисляет целлюлозу хиноном, про­дуктом деградации лигнина, восстанавливая его до фенола.

Известны целлюлазы, связанные с клетками, и каталитически активные внеклеточные целлюлазы. Целлюлазы микроскопиче­ских грибов являются секретируемыми ферментами, гидролизующими целлюлозу вне клетки. β-Глюкозидаза локализована внутри клетки. Ее субстрат может поступать из внешней среды и разлагаться в клетке. У грибов число определяемых целлюлолитических белков исчисляется десятками, из них большинство является множественными формами основных компонентов. Так, в составе наиболее изученных комплексов грибов Trichoderma reesei, Humicola insolens 7 компонентов, в том числе две целлобиогидролазы и пять эндоглюканаз. Кроме того, в целлюлолитической системе грибов обнаружены ксиланазы и маннаназы. Общее число генов, отвечающих за процесс разложения расти­тельного субстрата, индуцируемых целлюлозой, целлобиозой, лактозой, софорозой и репрессируемых глюкозой, составляет более полутора десятков, при этом они расположены по разным хромосомам гриба.

В целлюлазных системах грамположительной бактерии Cellulomonas fimi, актиномицета Thermomonospora fusca отсутству­ют характерные для грибов целлобиогидролаза I и эдоглюканаза I. У Cellulomonas fimi, Thermomonospora fusca имеются ферменты, специфичные к невосстанав­ливающему концу субстрата. Еще менее сходную с грибами целлюлолитическую систему имеет бактерия Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa. В нее входят три эндоглюканазы, целлодекстриназа, пять ксиланаз, четыре маннаназы, в дополнение к широкому спектру ферментов, отщепляющих боковые группы в гемицеллюлозах. Ферментные системы бацилл и фитопатогенных бакте­рий рода Erwinia еще более удалены от грибных, у них не обна­ружены целлобиогидролазы.

Анаэробные бактерии Clostridium thermocellum разлагают цел­люлозу с помощью сложноорганизованных высокомолекулярных внеклеточных структур — целлюлосом. Целлюлосомы обнару­жены на поверхности клеток Clostridium thermocellum и обычно содержат от 15 до 25 различных целлюлаз и гемицеллюлаз, объе­диняемых некаталитическим белком A (Cip А), получившим на­звание скаффолдина. Скаффоддин содержит необходимые струк­турные фрагменты для сборки целлюлосом, ее фиксации на по­верхности клетки и прикрепления к целлюлозному субстрату. Среди ферментов целлюлосом обнаружены как эндоглюканазы так и целлобиогидролазы. При контакте с целлюлозными ми­целлами целлюлосомы образуют волокнистую объемную сеть, заполняющую пространство между стенкой бактериальной клет­ки и целлюлозной мицеллой. Сродство целлюлаз к субстрату обеспечивает адгезию на поверхности целлюлозы в процессе гидролиза. Гидролиз целлюлозы с участием ферментов, ассо­циированных в целлюлосомы, происходит эффективно, так как ассоциированные ферменты более активны, чем растворенные ферменты. Примером действия ассоциированных бактериальных целлюлаз является гидролиз целлюлозы, имеющий место в руб­це жвачных животных. В гидролизе целлюлозы участвуют раз­личные бактерии, населяющие рубец. Около 5% целлюлаз рубцовой жидкости находятся в свободном состоянии, остальная часть представлена ассоциатами. Целлюлоза в рубце разлагается на 50% за 6-8 час.

Многообразие типов аминокислотных последовательностей, характерное для ферментов, классифицированных прежде под одним номером, наличие у одного организма разнообразных целлюлаз привели к необходимости введения их новых классификационных обозначений.Ферменты, катализирующие превращения растительных субстратов обозначают трехбуквенным сокращением (Cel, Xyn, Man, Lic, Lam).

Обозначать гликозилгидролазы трехбуквенным сокращением не делая при этом различий между экзо- и эндогидролазами предложили Хенриссат с соавторами (1998). В обозначение фермента вводится номер семейства, к которому принадлежит его каталитический домен (КД). По номеру определяют характер действия фермента при гидролизе гликозидной связи. Если каталитических доменов два или более, они указываются в обозначении через тире, начиная с N-конца полипептидной цепи. Последняя буква в краткой форме записи означает порядок открытия домена данного семейства у данного организма. Например, если у Clostridium thermocellum, обозначаемой как Ct, пять разных целлюлаз имеют каталитические домены семейства 5, то фермент, последовательность которого была идентифицирована первой, обозначается как CtCel5A, второй - как CtCel5B и т.д.

В таблице5 приведены примерыновой номенклатуры гликозилгидролазTrichoderma reesei.

Однако эти обозначения субъективны и ряд исследователей полагают, что неопределенность в обозначении ферментов одного организма, принадлежащих к одному семейству, уменьшилась бы, если бы за основу принимался не приоритет в открытии той или иной формы, а такие объективные физико-химические характеристики фермента как его молекулярная масса, изоэлектрическая точка или одновременно оба показателя. Это значительно облегчило бы соотнесение прежних, устоявшихся наименований ферментов с новыми. Новые ферменты даже у хорошо изученных организмов обнаруживают, чуть ли не ежегодно и неопределенность была бы значительно меньше, если указывать принадлежность открываемого фермента. Например, фермент родительского штамма обозначать (n – native), рекомбинантного организма (r – recombinant), а если рассчитан по нуклеотидной последовательности -(c – calculated).

Таблица 5

Примеры новой номенклатуры гликозилгидролаз Trichoderma reesei

(по Henrissat et al., 1998)

На взгляд отечественных исследователей в основе построения номенклатуры должно быть и указание типа действия каталитического домена фермента – целлобиогидролазного (с), эндоглюканазного (е) или смешанного (се), а также обозначены типы ферментов со смешанной целлюлазно-ксиланазной специфичностью (сх или ех). Такая характеристика облегчает идентификацию ферментов на основании их субстратной специфичности.

В связи с тем, что один и тот же организм способен образо­вывать несколько типов целлюлолитических ферментов, являю­щихся в большинстве своем мультидоменными белками, домены которых принадлежат к различным семействам, в начале 90-х годов прошлого столетия была предложена классификация цел­люлаз по структурным признакам каталитического домена (КД) на основе анализа распределения гидрофобных кластеров по полипептидной цепи.

12
• 3
• 4
• Далее ⇒