Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление пневмококка.
Материал для исследования
1. Мокрота (пневмония).
2. Слизь из зева (ангина).
3. Отделяемое из язвы (ползучая язва роговицы).
4. Выделение из уха (отит).
5. Гной (абсцесс).
6. Плевральный пунктат (плеврит).
7. Кровь (подозрение на сепсис).
Способы сбора материала
Способы сбора материала
1 (Лучше брать утреннюю мокроту (при специфической пневмонии мокрота имеет ржавый цвет).)
Основные методы исследования
1. Микроскопический.
2. Микробиологический.
3. Биологический.
Ход исследования
Первый день исследования
Первый день исследования
Биологическая проба. Немного (3-5 мл мокроты) эмульгируют в стерильном бульоне, 0,5 мл этой смеси вводят внутрибрюшинно белой мыши. Через 6-8 ч у мыши отмечаются признаки заболевания. В это время пневмококк уже можно обнаружить в экссудате брюшной полости. Экссудат берут стерильным шприцем. Из него делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения чистой культуры экссудат засевают на агар с сывороткой. Если мышь погибает или заболевает, делают посев крови из сердца на агар с сывороткой крови для выделения чистой культуры. Посевы ставят в термостат.
Ускоренный метод определения типа пневмококка (реакция микроагглютинации). 4 капли экссудата из брюшной полости зараженной мыши наносят на предметное стекло. К первой капле прибавляют агглютинирующую сыворотку I типа, ко второй - сыворотку II типа, к третьей - III типа, к четвертой - изотонический раствор натрия хлорида (контроль).
Сыворотки I и II типа предварительно разводят в соотношении 1:10, а сыворотку III типа - 1:5. Все капли размешивают, высушивают, фиксируют и окрашивают разведенным фуксином. При положительном результате в одной из капель отмечается скучивание микробов (агглютинация).
Второй день исследования
Посевы вынимают из термостата, просматривают и из подозрительных колоний делают мазки. При наличии в мазках грамположительных ланцетовидных диплококков 2-3 колонии выделяют на скошенный агар с сывороткой для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат. Из бульона делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Третий день исследования
Посевы вынимают из термостата. Проверяют чистоту культуры - делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в выделенной культуре грамположительных ланцетовидных диплококков проводят идентификацию выделенной культуры путем посева:
1) на среды Гисса (лактоза, глюкоза, сахароза, мальтоза) проводят посев обычным способом - уколом в среду;
2) на среду с инулином;
3) на среду с оптохином;
4) ставят пробу с желчью.
Проба на инулин. Исследуемую культуру засевают на питательную среду, содержащую инулин и лакмусовую настойку, и ставят в термостат. Через 18-24 ч посевы вынимают из термостата. При наличии пневмококков среда окрашивается в красный цвет (стрептококки консистенцию и цвет среды не меняют).
Определение чувствительности к оптохину. Выделенную культуру засевают на 10% агар с кровью, содержащий оптохин 1:50000. Пневмококки, в отличие от стрептококков, не растут на средах, содержащих оптохин.
Проба с желчью. В агглютинационные пробирки наливают по 1 мл исследуемой бульонной культуры. В одну из них добавляют каплю кроличьей желчи, вторая пробирка служит контролем. Обе пробирки помещают в термостат. Через 18-24 ч наступает лизис пневмококков, который выражается в просветлении мутного бульона. В контроле взвесь остается мутной.
Пробу с желчью можно поставить на плотной питательной среде. Для этого на колонию пневмококков, выросших в чашках с агаром и сывороткой, наносят крупинку сухой желчи - колония растворяется - исчезает.
Четвертый день исследования
Производят учет результатов (табл. 26).
Таблица 26. Дифференциация пневмококка от зеленящего стрептококка
Примечание. к - расщепление углеводов с образованием кислоты.
В настоящее время широко используются серологические методы исследования (РСК и РИГА) для определения стрептококковых антител. Определение группы и серовара выделенной культуры производят с помощью флюоресцирующих антител.
Определение вирулентности пневмококка. Суточную бульонную культуру пневмококка разводят 1% пептонной водой от 10-2 до 10-8, 0,5 мл каждого разведения вводят двум белым мышам. Культуру, вызвавшую гибель мышей в разведении 10-7, оценивают как вирулентную, в разведении 10-4-10-6 считают средневирулентной. Культура, не вызвавшая гибель мышей, авирулентна.
Контрольные вопросы
1. Какие методы выделения чистой культуры пневмококков Вы знаете?
2. Какое животное наиболее чувствительно к пневмококку?
3. Какие реакции ставят с экссудатом зараженной мыши и с какой целью?
4. От каких представителей гноеродных кокков следует дифференцировать пневмококк и с помощью какой пробы?
5. Как определить вирулентность пневмококков?
Задание
Составьте схему исследования мокроты, указав его этапы по дням.
Питательные среды
Агар с сывороткой (см. главу 7).
Бульон с сывороткой (см. главу 7).
Агар с кровью (см. главу 7).
Среды Гисса (сухие).
Среда для пробы с инулином. К 200 мл дистиллированной воды прибавляют 10 мл инактивированной бычьей сыворотки, 18 мл лакмусовой настойки и 3 г инулина. Стерилизуют текучим паром при 100° С 3 дня подряд. Желчный бульон (см. главу 7).
Менингококки
Род Neisseria включает два вида микробов, патогенных для человека: N. meningitidis и N. gonorrhoeae. Neisseria meningitidis были выделены из цереброспинальной жидкости больного Вексельбаумом (1887).
Морфология. Менингококки - это парные кокки, состоящие из двух бобовидных кокков, лежащих вогнутыми сторонами друг к другу, наружные стенки у них выпуклые (см. рис.4). Размер каждого кокка 0,6-0,8 × 1,2-1,5 мкм. Они полиморфны. Менингококки неподвижны, не имеют спор, образуют капсулу. Грамотрицательны. В чистых культурах располагаются тетрадами и в виде отдельных кокков без определенного порядка, а в мазках, приготовленных из спинномозговой жидкости, чаще располагаются попарно. В гнойном материале находятся внутри лейкоцита.
Культивирование. Менингококки - аэробы. Они требовательны к питательным средам, размножаются только на средах, содержащих нативный белок (сыворотку, кровь). Растут при температуре 36-37° С (при 25° С рост прекращается), рН среды 7,4-7,6. Для их размножения необходима влажная среда и повышенное количество углекислоты (фактор, стимулирующий их рост). Посев следует производить на свежеприготовленную среду.
На плотных питательных средах менингококки образуют небольшие 2-3 мм в диаметре, нежные, полупрозрачные, голубоватые, вязкие колонии. В бульоне с сывороткой менингококки дают легкую муть и небольшой осадок. Свежевыделенные штаммы в S-форме. Старые культуры могут диссоциировать, образовывать шероховатые R-формы колоний.
Ферментативные свойства. Биохимически менингококки мало активны. Они расщепляют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них не выражены (не створаживают молоко, желатин не разжижают).
Патогенность менингококков обусловливается наличием капсулы, которая препятствует фагоцитозу, пи лей, способствующих прикреплению микроба к поверхности эпителиальных клеток, и образованием ферментов: гиалуронидазы и нейраминидазы.
Токсинообразование. При разрушении бактериальных клеток высвобождается сильный термоустойчивый эндотоксин, который является липополисахаридом клеточной стенки. При заболевании он обнаруживается в крови и в спинномозговой жидкости больных. Тяжесть заболевания часто зависит от количества накопившегося токсина.
Антигенная структура. По полисахаридному (капсульному) антигену менингококки разделяют на серогруппы: А, В, С, D, X, Y U-135 29E (всего девять серогрупп).
Согласно международной классификации основными группами являются А, В и С. Менингококки группы А часто вызывают генерализованные процессы и имеют наибольшее эпидемиологическое значение. Менингококки групп В и С вызывают спорадические заболевания. Остальные серогруппы мало изучены.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Менингококки малоустойчивы. Температура 70° С губит их через 2-3 мин, 55° С - через 5 мин. В отличие от других кокков этой группы они плохо переносят низкую температуру, особенно чувствительны к температурным колебаниям.
Обычные концентрации дезинфицирующих растворов губят их быстро.
Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не чувствительны к менингококкам. Но при субдуральном введении менингококков обезьянам можно вызвать у них заболевание.
Внутрибрюшинное заражение морских свинок и белых мышей вызывает их гибель за счет действия эндотоксина.
Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.
Пути передачи. Основной путь воздушно-капельный.
Заболевания у человека:
1) назофарингит;
2) менингококкцемия;
3) цереброспинальный эпидемический менингит.
Патогенез. Попав на слизистую оболочку носоглотки, менингококки могут там локализоваться, обусловив носительство или вызвать острый назофарингит. Если они проникают в лимфатические сосуды, кровь и генерализуются, то вызывают глубокие изменения в паренхиматозных органах за счет действия эндотоксина. Развивается менингококкцемия. При проникновении менингококков в мозговые оболочки возникает гнойное воспаление - менингит. При менингококковом менингите спинномозговая жидкость мутная (в отличие от туберкулезного менингита). При спинномозговой пункции жидкость вытекает струей вследствие повышенного внутричерепного давления. Менингеальные явления характеризуются головной болью, ригидностью затылка, рвотой и т. д. Менингитом чаще болеют дети. У взрослых чаще заражение ограничивается носительством или назофарингитом.
Иммунитет. Постинфекционный иммунитет напряженный, он обусловливается опсонинами, комплементсвязывающими и бактериоцидными антителами. От интенсивности образования антител к полисахаридным и белковым антигенам зависит течение заболевания.
Профилактика. Сводится к раннему выявлению носителей, изоляции заболевших назофарингитом. Больные подлежат госпитализации.
Специфическая профилактика. Разработана химическая вакцина, состоящая из полисахаридов серогрупп А и С. Для экстренной профилактики используется иммуноглобулин.
Лечение. Антибактериальные препараты - пенициллин, левомицетин, ампициллин.
Контрольные вопросы
1. Каковы морфологические свойства менингококков?
2. На каких средах выращивают менингококки и какие условия необходимы для их размножения?
3. Какова биохимическая активность менингококков и их устойчивость во внешней среде?
4. Какие заболевания вызывают менингококки?
5. По какому антигену делят менингококки на серогруппы?