Выделение чистой культуры из отдельной колонии

Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов является метод, предложенный Р. Кохом. Принцип его заключается в получении чистой культуры из отдельной колонии. Однако этот метод неприменим для выделения микроорганизмов, которые не растут или плохо растут на плотных средах. К числу таких микроорганизмов относятся некоторые бактерии, многие водоросли и простейшие.

Рис. 6.2. Рассев культуры микроорганизмов

на поверхность плотной среды шпателем:

а — шпатель Дригальского; б — рассев; в — рост

микроорганизмов после рассева

 

При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов накопитель­ную культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следу­ющий. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную и охлажденную до 50 °С питательную среду, содержащую агар или желатину, разливают в сте­рильные чашки Петри. После того как среда застынет, на ее поверхность из пипетки наносят каплю накопительной культуры или ее разведения в стериль­ной воде и стерильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют кап­лю по поверхности плотной среды в чашке Петри. Далее этим же шпателем протирают поверхность среды последовательно во второй, третьей и четвертой чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдается сплош­ной рост микроорганизмов, тогда как в последующих — рост изолированных колоний (рис. 6.2). Рассевать накопительную культуру можно бактериологиче­ской петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную куль­туру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности плотной среды про­водят штрихи в порядке, указанном на рис. 6.3. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в пламени горелки.

После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1 —7 суток в зависимости от скорости роста микроорга­низмов. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды в пробирке или в жидкую среду.

Метод глубинного посева. Изолированные колонии микроаэрофильных мик­роорганизмов и факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного посева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15 —20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом про­бирки помещают в кипящую водяную баню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений накопительной культуры в стерильной водопроводной воде. Разведения готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0,5 — 1,0 мл раз­ведения получить изолированные колонии. Степень разведения определяется
плотностью накопительной культуры. Высевы делают, как правило, из трех-
четырех последних разведений. Для это­го в пробирку с расплавленной и остуженной до 48 — 50 °С средой вносят 0,5-1,0 мл одного из разведений на­копительной культуры. Посевной ма
териал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями.

 

Рис. 6.3. Схема последовательности (7 — 5)
рассева культуры микроорганизмов на поверхность плотной среды петлей

Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в стерильную чашку Петри. После того как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем, извлекают стерильными капиллярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.

Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу гибели клеток, то посев проводят на поверхность среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения накопи­тельной культуры проводят в расплавленной и охлажденной до 45 — 50 °С агаризованной питательной среде. Делают 6—10 последовательных разведений. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем сте­рильной смеси парафина и вазелинового масла (в соотношении 3:1), что пре­пятствует проникновению воздуха в толщу агаризованной среды.

Иногда агаризованную питательную среду после посева и тщательного перемеши­вания переносят в стерильные трубки Бурри. Можно использовать капиллярные пи­петки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение накопительной куль­туры в расплавленной агаризованной питательной среде. Конец капилляра запаивают. При удачно выбранном разведении накопительной культуры в одной из пробирок (пи­петок Пастера, трубок Бурри) вырастают изолированные колонии. Чтобы извлечь об­разовавшиеся колонии, поступают следующим образом. Удаляют стерильной иглой слой парафина, а столбик агаризованной среды осторожно выдувают из пробирки в стерильную чашку Петри, пропуская газ, не содержащий кислород, через капилляр или иглу, помещенные между стенкой пробирки и агаризованной средой. Агаризован­ную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

В некоторых случаях плотную среду из пробирки извлекают иначе. Пробирку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непо­средственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарово­го столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным ланцетом и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярны­ми трубками или петлей. Можно также вырезать их стерильным ланцетом. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микро­организмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщатель­ной дезинфекции поверхности его разламывают стерильным пинцетом и участки ка­пилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Для получения изолированных колоний методом глубинного посева и ме­тодом разведений рекомендуется использовать осветленные питательные среды.

Метод вращающихся пробирок. Когда хотят получить изолированные колонии облигатных анаэробных бактерий, характеризующихся особенно высокой чувствительностью к кислороду (экстремальные анаэробы), используют метод вращающихся пробирок Р. Хангейта. Сущность его заключается в следующем. Расплавленную агаризованную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку стерильного инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Агаризованная среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Тонкий слой агаризованной среды в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооружен­ным глазом (см. рис. 6.4). Применяют также модификацию метода Р. Хангейта. При этом расплавленную агаризованную среду при постоянном токе стерильного инертно­го газа разливают по пробиркам. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и по­мещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. После того как среда на стен­ках пробирки застынет, производят засев среды в этой пробирке в токе стерильного газа с помощью бактериальной петли, проводя штрих во вращающейся пробирке в направлении от ее дна к горлышку (рис. 6.5). Иногда для получения чистой культуры бывает достаточно одного посева в плотную среду, однако чаще посев в плотную питательную среду повторяют 2—3 раза. В качестве посевного материала при этом используют культуру, по­лученную из отдельной колонии.