Тема №8. Биохимические свойства микробов и методы их изучения.

Цель занятия: изучить биохимические свойства микроорганизмов.

Материалы и оборудование: питательные среды, штативы с пробирками, чашки Петри, пастеровские пипетки, бактериальные петли, термостат.

В жизнедеятельности микробов ферменты играют большую роль, т.к. участвуют в разнообразных биохимических реакциях, лежащих в основе функций питания, дыхания, размножения. Ферменты делятся на внутри- и внеклеточные. Каждый вид микроорганизмов продуцирует постоянный набор ферментов. Для обнаружения ферментов исследуемую культуру засевают на специальные дифференциально-диагностические питательные среды.

Сахаролитические ферменты расщепляют углеводы и высокоатомные спирты, которые объединяют в 1 группу – сахара. Сахара альдегиды и кислоты СО3 и Н2. Характерно, что различные виды и разновидности микробов относятся по–разному к одним и тем же сахарам (одни бактерии, ферментируя лактозу, остаются нейтральными в отношении глюкозы). Это свойство используется в бактериальной практике для дифференциации различных видов и разновидностей бактерий.

Исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гиса, называемые «пестрым» рядом. «Пестрый» ряд содержит 5 пробирок с: глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой, сахарозой. При некоторых исследованиях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гиса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой.

Сахара и спирты должны быть химически чистыми. Пестрый ряд обусловлен тем, что под действием растущего микроба одни углеводы остаются неизмененными и цвет питательной среды не меняется, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и цвет питательной среды.

Среды бывают жидкими и полужидкими (с добавлением 0,2 – 0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими средами Гиса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают «поплавок» (трубочку диаметром 0,5-0,7 мм, запаянную с одного конца) запаянным концом кверху; при стерилизации он полностью заполняется питательной средой. По мере образования в среде газообразных продуктов вытесняется часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек. В полужидких средах Гиса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стойкой пены на ее поверхности.

Т.о., при изучении сахаролитических ферментов, учитывают не только явление расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в питательной среде конечных газообразных продуктов.

Пробирки с набором сред Гиса ставят в штатив в 1 ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, номер и вид исследуемого микроба. Культуру берут на кончик петли в небольшом количестве и засевают по общепринятой методике. Инкубируют в термостате. И проводят учет результатов. Изменение цвета питательной среды в пробирке обозначают «К» (кислота), «Г» (газ). В протоколе обозначается также.

Протеолитические ферменты. Некоторые микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеазы, расщепляющие белки. Белки пептоны, альбумины полипептиды и отдельные аминокислоты.

Чистую культуру засевают в питательную среду, содержащую белок (желатина, свернутая лошадиная сыворотка, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса). Протеолитическая активность одного и того же микроба на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обуславливается специфичностью ферментов. Поэтому рекомендуют питательные среды различного состава.

Определение протеолитической активности микробов на желатине. МПЖ разливают в пробирки по 5-6 мл. Посев производят уколом, погружая петлю с исследуемой культурой вглубь до дна. Микробы, способные расти при низкой температуре, оставляют стоять в комнате при 20 – 22°С, остальные посевы инкубируют в термостате при 37°С. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят 1 или 2 пробирки с незасеянной желатиной для контроля. При 37°С желатина плавится, поэтому после инкубации пробирки опускают в холодную воду. После застудневания желатины в контрольных пробирках приступают к просмотру роста и учету изменений в питательной среде опытных пробирок. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатины, отмечается разжижение питательной среды. Пробирки, в которых изменений не произошло, оставляют еще на 20 суток, в течение которых ведется наблюдение. В протоколе исследования обязательно отмечают день появления признаков разжижения среды, степень и характер.

Определение протеолитической активности микробов на молочном агаре Эйкмана. Молочный агар Эйкмана разлитый и остуженный в чашках Петри засевают (петлей / шпателем) исследуемую культуру микроорганизмов. Через 24-48 ч инкубации происходит пептонизация молочного белка (казеин), в результате чего вокруг таких колоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочно – мутном фоне.

Определение протеолитической активности микробов на свернутой кровяной сыворотке. Культуру аэробных микроорганизмов засевают на чашки, анаэробных – уколом в столбик свернутой лошадиной сыворотки, инкубируют при 37°С. Штаммы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

Определение протеолитической активности микробов в бульоне с куриным яичным белком. В пробирку с МПБ или бульоном Хоттингера, содержащим кусочек свернутого куриного белка, вносят 1 петлю исследуемой культуры. Посевы просматривают через сутки и затем в присутствии положительных результатов – ежедневно в течение 5 дней.

Протеолитически активные культуры микробов расщепляют коагулированный яичный белок: кусочки белка, содержавшиеся в среде, заметно уменьшаются, превращаясь в крошкообразную массу, или полностью растворяются. Аналогично проявляются данные свойства и в средах с кусочками вареного мяса.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индола, H2S, мочевины, NH3. При определении видов и дифференциации разновидностей патогенных микробов наибольшее значение имеет выявление индола, H2S.

Определение индола в культуре микробов (по Морелю).

Индол образуется при расщеплении триптофана. Петлю с культурой засевают в МПБ Хоттингера, содержащим большое количество свободного триптофана. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты. Инкубируют 24 – 28 ч. Образование индола будет сопровождаться окрашиванием индикаторной бумаги в слабо – розовый.

Определение сероводорода. Это конечный продукт расщепления аминокислот: цистина, цистеина, метионина, содержащих серу. Петлю с культурой засевают в пробирку с МПБ или бульоном Хоттингера. Тотчас вносят пропитанную уксуснокислым свинцом полоску индикаторной бумаги. В положительных случаях индикаторная бумага приобретает черно – бурое окрашивание (образование сернокислого свинца). Окончательный учет результатов на образование индола и H2S производят на 7 – 10 день после посева, т.к. процесс ферментативного расщепления белка и образования конечных продуктов распада происходит длительное время.

Окислительно-восстановительные ферменты. Связаны с дыхательной функцией микроорганизма. Характерным для этого типа реакции является то, что окисление вещества всегда сопровождается восстановлением (редукцией) другого органического вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, является донором, а вещество, к которому присоединяется – акцептором (кислород воздуха). Для выявления дегидраз и определения их активности предложен метод, основанный на введении в питательную среду органической краски, выполняющей роль акцептора водорода. В результате присоединения водорода краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединение, называемое лейкобазой, которое при обильном доступе кислорода может вновь окислиться и приобрести прежний цвет. В качестве акцептора используют метиленовую синь, лакмусовую настойку, малахитовую зелень и др.

Для выявления восстанавливающих свойств указанные красители добавляют к обычным пит.средам: МПБ, МПА, молоку. Один и тот же вид микроба ведет себя неодинаково по отношению к краскам разного состава. Данное свойство используется в качестве дифференциального признака (бактерии брюшного тифа редуцируют метиленовую синь, но не редуцируют лакмуса и не изменяют нейтральность в противоположность E.coli, которая остается нейтральной в отношении метиленовой сини, но восстанавливает лакмус и нейтральность)

Определение редуцирующей способности.

1. в 5 мл среды (молоко +метиленовая синь) засевают петлю исследуемой культуры с плотной пит.среды или 0,1 мл 14 часовой бульонной культуры после 24 ч инкубации отмечают результаты. При (+) результате среда из голубой становится кремового цвета, а при слабо положительной – зеленоватое окрашивание.

2. Пробирки со средой засевают так же, как молоко с суточной культурой с плотной или жидкой питательной среды инкубируют 10 дней, ежедневно наблюдая за изменением цвета среды. Редукция лакмуса проявляется полным обесцвечиванием молока, которое до посева было розовато – сиреневое. В протоколе исследования редукцию лакмуса обозначают «Р».

Среда Минкевича позволяет выявлять кислото- или щелочеобразование, выражающееся соответственно в покраснении или посинении молочной среды. Образование кислоты обозначают «К», щелочи – «Щ».

Определение каталазы. Некоторые микроорганизмы (аэробы) в процессе дыхания образуют Н2О2 , являющуюся клеточным ядом. Количество Н2О2 не достигает высоких концентраций, т.к. Н2О + О2 (при участии фермента каталазы). Определением наличия каталазы пользуются при идентификации вида и дифференциации разновидностей патогенных микробов, выделенных из организма больного и объектов внешней среды.

На поверхность микробной культуры, выращенной на плотной питательной среде в чашке Петри, наносят 1- 2 мл 1%р-ра Н2О2 так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании О2 в результате расщепления Н2О2 под действием каталазы. Данный результат в протоколе отмечается (+) как положительный на каталазу.