Лабораторная диагностика туберкулеза и микобактериозов
Легочные и внелегочные формы туберкулеза вызываются бактериями комплекса МТС (Mycobacterium tuberculosis complex), а также нетуберкулезными микобактериями комплекса MAC (M.avium complex, M.kansassii).Микобактерии комплекса МАС чаще поражают лиц с иммунодефицитами различной этиологии (прежде всего, больных СПИДом). Методы микробиологической диагностики туберкулеза представлены в схеме 15.
Схема 15.Микробиологическая диагностика туберкулеза
|
|
Материалом для исследования является мокрота, промывные воды бронхов, желудка бронхоальвеолярная жидкость, плевральный эксудат, кровь, моча, испражнения, синовиальная жидкость, биоптаты различных тканей.
Первичная обработка материала заключается в его обработке с целью деконтаминации при наличии посторонней микрофлоры, а также разжижения, гомогенизации и флотации при исследовании мокроты, бронхоальвеолярной жидкости и т.д. Для этого материал обрабатывают муколитическими (N-ацетил--цистеин) и антибактериальными (1-2% NaOH) веществами, центрифугируют 20 мин при 3000 g и супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в небольшом количестве ИР.
Микроскопический методзаключается в микроскопическом исследовании мазков из исследуемого материала, окрашенных специальными методами с целью выявления кислото-
устойчивых бактерий, что позволяет дать ориентировочное заключение. Отрицательный результат микроскопического исследования не является основанием для снятия диагноза «туберкулез». В настоящее время основным методом выявления микобактерий является люминес-
центная микроскопия препаратов, окрашенных аурамином в концентрации 1:1000 в течение 15 минут с последующим обесцвечиванием 3% солянокислым спиртом в течение 30 сек, промывкой и докрашиванием мазка в течение 1 минуты водным раствором родамина 6ж в концентрации 1:5000. Микобактерии обладают ярким желтым свечением на темном фоне. Метод Циля-Нильсена применяется реже (рис. 20). Обычно по Цилю-Нильсену окрашивают мазки из чистых культур. Ограничением бактериоскопического метода является то, что он не позволяет дифференцировать микобактерии между собой и от других кислотоустойчивых микроорганизмов.
Рис. 20. Туберкулезная палочка (Mycobacterium tuberculosis) в мокроте больного. Окраска по Цилю-Нильсену. Рубиново-красные палочки (одиночные или скоплениями) на голубом фоне. х 900
Бактериологический метод является основным методом диагностики туберкулеза, обладая высокой чувствительностью и специфичностью.
Для культивирования микобактерий наиболее часто применяют среду Левенштейна- Йенсена, содержащую суспензию свежих яиц, крахмал, глицерин, аспарагин, КН3РО4, сульфат и цитрат магния, а также краситель малахитовый зеленый. Среду свертывают в наклонном положении при 850 С в течение 45 мин. Применяются также другие яичные среды (Финна, мордовского) и синтетические жидкие питательные среды.Посевы инкубируют в термостате при температуре 370 С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (5-10 %) в течение не менее 8 недель, просматривая посевы каждые 3 дня. Культуры М.tuberculosis растут в шероховатой R-форме в виде крошкообразных или морщинистых колоний кремового цвета (рис. 21). Отсутствие роста микобактерий спустя 8 недель после посева свидетельствует об отрицательном результате бактериологического метода диагностики туберкулеза.
Для культивирования микобактерий применяется также метод микрокультур Прайса. Для этого на нескольких узких предметных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабатывают несколько минут 2-6 % серной кислотой, после чего нейтрализуют. Затем стекла опускают в пробирки с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4-1:8 и ставят в термостат. Через 7-14 стекла дней извлекают, препараты фиксируют, окрашивают по методу Циля-Нильсена и микроскопируют. Вирулентные штаммы микобактерий характеризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора.
Рис. 21. Колонии туберкулезной палочки на среде Левенштейна-Иенсена
Идентификация выделенной культуры микобактерий до вида осуществляется по общепринятой схеме на основании изучения типичной морфологии, характерных культуральных свойств (по температурному оптимуму, скорости роста, пигментоообразованию в темноте и на свету), биохимической активности (наличие нитратредуктазы, каталазы, уреазы, пиразинамидазы, продукции никотиновой кислоты - ниациновая проба, восстановления нитратов и теллурита калия, гидролиза твина-80), а также с применением молекулярно-генетических (ДНК-гибридизация) и химических методов, что позволяет сократить время на лабораторную диагностику туберкулеза до 4-7 дней.
Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина; положительная реакция характеризуется появлением ярко-желтой окраски. После учета результатов реакции KCN нейтрализуют добавлением в пробирки 3-5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.
Проводится также определение чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам методом абсолютных концентраций ( наиболее часто на жидких питательных средах или методом микрокультур по Прайсу, занимая время от 3 недель до 3 месяцев или на плотной среде Левенштейна-Йенсена) с оценкой результатов по задержке роста или по нитратредуктазной активности, что имеет важное значение для назначения адекватной терапии. Границы устойчивости туберкулезной палочки составляют для стрептомицина 5 мкг/мл, ПАСК – 10 мкг/мл, тубазида – 1 мкг/мл, циклосерина и этионамида – 30 мкг/мл. Разработана также ПЦР для определения чувствительности микобактерий к химиопрепаратам и антибиотикам. К другим методам определения лекарственной устойчивости М.tuberculosis относятся биологический (LRP –Luciferase-Reporter Phage – свечение резистентных микобактерий в присутствии генетически измененных бактериофагов, несущих ген люциферазы) и молекулярно-генетический, основанный на ПЦР.
Биопробаранееиспользоваласьдля выделения микобактерий путем подкожного заражения морской свинки (чувствительны к М.tuberculosis) и кролика (чувствительны к M.bovis) материалом от больного с последующим наблюдением за животными (до 4 месяцев). По истечении этого срока или при гибели животных проводилось микроскопическое и бактериологическое исследование органов с целью обнаружения туберкулезных микобактерий. В настоящее время биопроба в реальной практике применяется редко в связи с утратой антибиотикорезистентных штаммов микобактерий вызывать типичную инфекцию и гибель животных.
Генодиагностика. Разработана ПЦР, позволяющая обнаружить видоспецифические нуклеиновые кислоты микобактерий комплекса МТС (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) непосредственно в клиническом материале от больного и дифференцировать туберкулезные микобактерии от нетуберкулезных – комплекс МАС (M. avium, M. kansassii). Метод ПЦР сопоставим с бактериологическим исследованием, однако выполняется быстро - в течение 24 часов.
При положительных результатах исследования методами бактериоскопии и ПЦР диагноз туберкулеза подтверждается и рекомендуется немедленное назначение противотуберкулезных препаратов по общепринятой схеме. Отрицательный результат ПЦР при обнаружении кислотоустойчивых микобактерии в мазках исключает наличие туберкулезных микобактерий комплекса МТС, поэтому в данной ситуации назначаются антимикробные препараты, активные в отношении нетуберкулезных микобактерии комплекса МАС. В других случаях необходимо ждать результатов бактериологического исследования.
Серодиагностика.Разработаны РСК, РНГА и другие серологические реакции для определения антител в сыворотке крови больных туберкулезом к антигенам микобактерий туберкулеза, однако диагностического значения эти реакции не имеют.
Аллергодиагностика.Ставится внутрикожная аллергическая проба (реакция Манту) с туберкулином - очищенной белковой фракцией, полученной из фильтрата убитой нагреванием бульонной культуры М.tuberculosis. Учет реакции производится через 24-48 часов. Проба используется для оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакцинации и отбора лиц для ревакцинации против туберкулеза.