Вірусологічні методи дослідження
методи вивчення біології вірусів та їх ідентифікації. У вірусології широко використовуються методи молекулярної біології, з допомогою яких вдалося встановити молекулярну структуру вірусних частинок, способи проникнення їх в клітку і особливості репродукції вірусів, первинної структури вірусних нуклеїнових кислот і білків. Розвиваються методи визначення послідовності складових елементів вірусних нуклеїнових кислот і амінокислот білка. З'являється можливість зв'язати функції нуклеїнових кислот і кодованих ними білків з послідовністю нуклеотидів і встановити причини внутрішньоклітинних процесів, що грають важливу роль в патогенезі вірусної інфекції.
Вірусологічні методи дослідження засновані також на імунологічних процесах (взаємодія антигену з антитілами), біологічні властивості вірусу (здатність до гемаглютинації, гемолізу, ферментативна активність), особливості взаємодії вірусу з клітиною-господарем (характер цитопатичної ефекту, освіта внутрішньоклітинних включень і т.д.).
В діагностиці вірусних інфекцій, при культивуванні, виділення та ідентифікації вірусів, а також при отриманні вакцинних препаратів широко застосовують метод культури тканин і клітин. Використовують первинні, вторинні, стабільні перевиваемие і диплоїдні клітинні культури. Первинні культури отримують при диспергирование тканини протеолітичними ферментами (трипсином, коллагеназой). Джерелом клітин можуть бути тканини і органи (частіше нирки) ембріонів людини і тварин. Суспензію клітин в живильному середовищі поміщають в так звані матраци, бутлі або чашки Петрі, де після прикріплення до поверхні судини клітини починають розмножуватися. Для зараження вірусами використовують зазвичай клітинний моношар. Живильну рідину зливають, вносять вірусну суспензію в певних розведеннях і після контакту з клітинами додають свіжу живильне середовище, зазвичай без сироватки
67. Всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою: 1) для виявлення антитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних антигенів-діагностикумів - для серологічної діагностики інфекційної хвороби; 2) для визначення невідомих антигенів (бактерій, грибів, вірусів) за відомими стандартними сироватками-антитілами - для серологічної ідентифікаціїзбудників.Якщо в реакції антитіла з антигеном беруть участь низькодисперс-ні антигени (бактерії, клітини), спостерігається феномен, або реакція, аглютинації (РА); при взаємодії антитіл з високодисперсними антигенами (полісахариди, білки та їх комплекси) утворюються преципітати (флокуляти). У реакції преципітації (РП) завдяки полівалентній природі антигену й антитіла утворюються ґратчасті структури, будова яких залежить від кількісного співвідношення антигену й антитіла
Коли до комплексу антиген — антитіло приєднується комплемент, відбувається реакція зв'язування комплементу (РЗК).
Взаємодія антитіла з антигеном може зумовлювати нейтралізацію токсину антитоксином (РН), активацію системи комплементу, реакцію негайної гіперчутливості.
Антитіла, що належать до класів IgA і IgE, не мають властивості спричинювати РП, РА, РЗК-
У ряді випадків з'єднання антитіла з антигеном може бути неміцним; оборотність комплексу антиген—антитіло відбувається в результаті конформаційних змін молекули антитіла, при надлишку антигену або зменшенні спорідненості між антигеном і антитілом, а також під впливом зовнішніх факторів (температура, кислотність середовища та ін.).
Усі імунологічні реакції поділяють на моно- й полісистемні.РЕАКЦІЯ АГЛЮТИНАЦІЇ Аглютиніни — антитіла, що мають властивість спричиняти склеювання відповідних бактерій, еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, клітин тканин, корпускулярних хімічних часточок з адсорбованими на них антигенами або антитілами з утворенням конгломератів (аглю-тинатів), видимих неозброєним оком.
Додавання відповідних імунних сироваток до зависі бактерій спричиняє їх аглютинацію і випадання в осад у виглядіпластівців або зерен. В реакції аглютинації (моносистемній, прямій, двокомпонентній) беруть участь антитіло (аглютинін) і корпускулярний антиген (аглютиноген); вони взаємодіють у певних кількісних співвідношеннях і при наявності електроліту (0,85 % розчин натрію хлориду).
РА бактерій з відповідними аглютинуючими сироватками характеризується специфічністю. Проте може траплятися групова аглютинація, тобто склеювання близьких, споріднених мікроорганізмів, хоч і в слабших розведеннях сироватки. Схематично це можна зобразити так: бактерія А містить аглютиногени а, Ь, с, бактерія В — b, c, d, бактерія С — с, d, є, а в сироватках крові імунізованих тварин утворюються відповідні їм аглютиніни.
Для виявлення специфічних аглютинінів у сироватках крові тварин, імунізованих складним комплексом антигенів бактеріальної клітини, застосовують метод адсорбції аглютинінів (реакція виснаження Кастеллані).
За допомогою методу адсорбції аглютинінів вивчають також антигенну структуру бактерій; крім того, його використовують для приготування специфічних аглютинуючих і лікувальних сироваток, вакцин і діагностикумів. Аглютинуючі сироватки, добуті методом адсорбції аглютинінів, називають монорецепторними. Вони дають змогу точніше визначати видову залежність низки збудників інфекційних захворювань.
При імунізації тварин рухливими бактеріями, що містять джгутикові (Н) і соматичні (О) антигени, у них виробляються відповідно Н- і О-аглютиніни. Джгутикові аглютиніни спричиняють швидше склеювання бактерій у вигляді пухких пластівців, соматичні аглютиніни порівняно повільно утворюють конгломерати бактерій у вигляді дрібних зерен. На цій підставі Н-аглютинація називається крупнопластівцевою, а О-аглютинація — дрібнозернистою.
Бактерії, що містять Vi-антиген, слабко або зовсім не аглютинуються О-сироватками, але добре аглютинуються Vi-сироватками. Це доводить, що О- і Vi-антигени, так само як О- і Vi-антитіла, мають різну структуру.
При здійсненні РА треба враховувати феномен затримки аглютинації. Це бувє як при занадто великих, так і при малих концентраціях імунної сироватки, взятої для РА. Цей феномен властивий усім реакціям імунітету і має враховуватись при лабораторній діагностиці інфекційних захворювань.
РА широко застосовують для серологічної діагностики черевного тифу, паратифів А і В (реакція Відаля), бруцельозу (реакція Райта), висипного тифу (реакція з рикетсіями Провачека), туляремії, лептоспірозу та інших захворювань, коли за допомогою відомих бактерій (діагностикумів) визначають у сироватці крові хворих відповідні аглютиніни.
РА використовують для ідентифікації виділених у хворих, людей і тварин мікроорганізмів із застосуванням заздалегідь відомих аглютинуючих сироваток.
Крім прямої аглютинації, у практиці діагностики інфекційних захворювань застосовують також реакцію непрямої гемаглютинації (РИГА), сутність якої полягає в тому, що антиген, який використовується для проведення РА з сироватками крові хворих, попередньо адсорбований на поверхні еритроцитів барана. Зокрема, РНГА застосовують при діагностиці черевного, висипного тифу і паратифів, туберкульозу, токсоплазмозу та ін. Для здійснення РНГА можна використати спеціальні еритроцитарні діагностикуми (завись формалізованих еритроцитів, «навантажених» антигенами або антитілами).
Стафілококів
1. Реакція преципітації відрізняється від аглютинації за характером антигенів: в реакції аглютинації вони корпускулярні, навіть цілі клітини, а в реакції преципітації – молекулярні, в розчинному стані. Антигенами можуть бути екстракти мікроорганізмів, тканин, органів, хімічні речовини.
Реакція преципітації(РП) — взаємодія розчинного антигену (пре-ципітиногену) й антитіла (преципітину) в присутності електроліту (0,85 % розчин натрію хлориду).
РП має високу чутливість і специфічність. Вона дає змогу виявити антиген (преципітиноген) у розведенні 1 : 1 000 000 і 1 : 10 000 000. Як преципітиногени можуть бути використані білки тваринного, рослинного і бактеріального походження: кров, сироватка крові, екстракти з різних органів і тканин, харчових продуктів білкового походження (м'ясо, риба, молоко), фільтрати культур мікроорганізмів або тканин, уражених ними. Преципітиногени збудників сибірки, чуми, туляремії термостійкі. Деякі преципітиногени витримують нагрівання до температури 120—180 °С.
Відомо понад 20 модифікацій РП, які поділяють на кілька груп: РП у пробірках, капілярах, на предметних стеклах, фільтрувальному папері, ацетатцелюлозній плівці, в гелі та ін.
РП використовують у діагностиці сибірки, туляремії, віспи та ін., а також при вивченні антигенної структури деяких груп бактерій. У судовій медицині за допомогою РП визначають видову належність плям крові, сперми; в санітарній експертизі виявляють домішки молока одного виду тварини у молоці іншого виду, добавляння штучного меду до натурального, фальсифікацію м'ясних, рибних, борошняних виробів і т. д. У біології РП застосовують для встановлення генетичних зв'язків близьких між собою видів тварин, рослин, мікроорганізмів.
Феномен преципітації полягає в тому, що антитіла (преципітини), зєднуючись із розчинними антигенами (преципітиногенами), зумовлюють утворення осаду (преципітату) або помутніння розчину. За титр реакції приймають найбільше розведення антигена, яке дає позитивний результат.
6Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР або PCR)
— експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК в біологічному матеріалі (пробі). Крім простого збільшення числа копійДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад дляклонування генів, введення мутацій, виділення нових генів,секвенування, для створення і визначення генетично модіфікованих організмів, діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.
Хід реакції[]
Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20—35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій (див малюнок 2):
1. Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94—96 °C (або до 98 °C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5—10 хв., щоб ланцюги ДНК розділилися. Ця стадія називається денатурацією — руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами. Іноді перед першим циклом проводять попереднє прогрівання реакційної суміші протягом 2—5 хв. для повної денатурації матриці і праймерів.
2. Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоби праймери могли зв'язатися з одноланцюговою матрицею. Ця стадія називається відпалом (англ. annealing). Температура відпалу залежить від праймерів і зазвичай вибирається на 4—5°С нижче за їх температуру плавлення. Час стадії — 0,5—2 хв.
3. ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюжок, використовуючи праймер як затравку. Це так звана стадіяелонгації. Температура елонгації залежить від полімерази. Полімерази Taq і Pfu, що найчастіше використовуються, найактивніші за 72 °C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагмента, який ампліфікують. Середня швидкість елонгації — 1000 пар основ за 1 хв. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 10—15 хв.